تهيه رنگ متيلن بلوی بافره (گسترش مستقيم)

(Nairs BufferedMethylene blue stain Direct smear) 

این روش آماده سازی گسترش مستقیم جهت مشخص نمودن جزئیات هسته تروفوزوئیتها و افتراق آنها از ماكروفاژها به كار می رود، بویژه زمانی كه از محلول با PH پائین استفاده شود كه سبب نفوذ هر چه بیشتر رنگ به داخل ارگانیسم می گردد.
بعد از 5 تا 10 دقیقه سیتوپلاسم به رنگ آبی كمرنگ و هسته به رنگ آبی بسیار پر رنگ دیده می شود. گسترشها باید در مدت 30 دقیقه مورد بررسی قرار گیرند.

روش كار
1- تهیه محلول ذخیره A

11/55 میلی لیتر از اسید استیك (CH۳COOH) را با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر می رسانیم .

2- تهیه محلول ذخیره B

16/4 گرم استات سدیم بدون آب (Nac2 H3O2 ) و یا 27/2 گرم استات سدیم با 3 ملكول آب (NaC HO 3HO) را در آب مقطر حل نموده و حجم نهائی را به 100 میلی لیتر می رسانیم.

طبق جدول زیر محلول A و B را مخلوط نموده و با آب مقطر به حجم 10 میلی لیتر می رسانیم :

  
0/06 گرم ( ۶۰ میلی گرم ) پودر میتلن بلو را به 100 میلی لیتر از محلول بافر اضافه كرده و كاملا” حل می نمائیم. معمولا” استفاده از بافر استات با 3/6=PH بهترین نتیجه را ایجاد می كند.

روش انجام آزمایش مستقیم
1- یك قطره سرم فیزیولوژی 0.85% را در طرف چپ و یك قطره از محلول لوگل را در طرف راست لام قرار می دهیم.
2- مقدار خیلی كمی از مدفوع ( به اندازه 2۲ میلی گرم و یا در حدی كه فقط نوك یك اپلیكاتور را به داخل نمونه فرو كنیم ) را در سرم فیزیولوژی به حالت یكنواخت در می آوریم. اگر بیشتر از این مقدار برداشت شود، گسترش غلیظ شده و یافتن انگل مشكل می شود و چنانچه مقدار كمتری از نمونه برداشته شود، گسترش رقیق شده و احتمال مشاهده انگل كم می شود.
عمل فوق را به وسیله اپلیكاتور دیگری با محلول لوگل انجام می دهیم. می توان یك قطره از محلول متیلن بلوی بافره را نیز بر روی لام دیگری قرارداد و به طریق فوق نمونه مدفوع را در آن به حالت یكنواخت در آورد.

جهت بررسی نمونه های فوق یك لامل (mm) 22×22 بر روی نمونه تهیه شده قرار می دهیم .
ترجیحا” می توان نمونه های تهیه شده در سرم فیزیو لوژی و ید را بر روی لامهای جداگانه ای قرار داد كه در این صورت امكان جاری شدن مایع بر روی میكروسكوپ كاهش می یابد .
اگر نمونه آبكی یا موكوئیدی باشد، نمونه برداری بوسیله اپلیكاتور مشكل است، لذا از دو اپلیكاتور به كمك هم طوری استفاده كنید كه حالت یك قاشقك را ایجاد نماید .
جهت بررسی گسترش ابتدا با عدسی با بزرگنمایی كم ( 10× ) تمام قسمتهای گسترش (لامل ) رابررسی می كنیم. اگر مورد مشكوكی مشاهده گردید از عدسی با بزرگنمایی ( 40× ) برای بررسی جزئیات استفاده می نماییم . حتی در مواردی كه مورد مشكوكی مشاهده نگردید ، حداقل یك سوم لامل باید با عدسی با بزرگنمایی ( 40× ) مورد بررسی مجدد قرار گیرد .
معمولا” تك یاخته ها نور را منعكس می كنند و چون این گونه ارگانیسمها كمرنگ می باشند ، می توانند نور را ازخود عبور دهند و مشاهده آنها مشكل گردد. بنابراین باید با نور كم، گسترشها را بررسی نمود .
زمانیكه نور زیاد باشد بیشتر ارگانیسمها به خوبی مشاهده نمی شوند ( تجربه نویسنده : بخصوص در زمانیكه نمونه محتوی اووسیست ایزوسپورابلی باشد) .
بهتر است عمل كاهش نور را به جای پایین آوردن كندانسور با بستن دیافراگم انجام دهید. میزان نور باید به نحوی تنظیم شود كه عناصر سلولی موجود در مدفوع بخصوص كیست تك یاخته ها بتوانند نور را منعكس كنند.
اگر اطراف لامل كاملا” با پارافین مذاب مسدود شده باشد، می توان با استفاده از عدسی روغنی ( بزرگنمایی 100 × ) آن را بررسی نمود . ترجیحا” در این موارد استفاده لامل ضخیم توصیه می شود .
در صورت استفاده از محلول غلیظ ید عناصر داخل مدفوع به یكدیگر چسبیده و سبب كاهش انكسار، عبور نور از ارگانیسم و اشكال در تشخیص می گردد و چنانچه محلول رقیق ید مورد استفاده قرار گیرد، عناصر داخل ارگانیسم به خوبی رنگ نمی گیرند . استفاده از محلول لوگلی كه در رنگ آمیزی باكتریها استفاده می شود، به دلیل غلظت آن جهت رنگ آمیزی انگلها توصیه نمی گردد .
چنانچه در بررسی گسترش ، حركت تروفوزوئیت كم شده باشد، می توان با قرار دادن یك سكه كوچك گرم شده در كنار گسترش ، حركت آن را تحریك نمود . همچنین با فشار روی لامل نیز می توان باعث حركت مایع و تحریك تروفوزوئیت جهت حركت نمودن گردید.

گزارش نتایج
مثالهایی از گزارش نتیجه مثبت مدفوع ، شامل موارد زیر می باشد :

1- Giardia lambliatrophozites present
2- Entamoeba colicysts present
3- Ascarislumbricoides eggs present
4- Strongyloidesstercoralis larva present
5- Isospora bellioocysts present

همه عناصر و سلولهای موجود در نمونه مدفوع نیز باید تشخیص داده شده و گزارش گردند، مانند:
Moderate charcot _ ledencrystals present.
Few red blood cells ( RBCS ) present.