Aspergillus spp.روش­های مولکولی تشخيصی

پيام بهزادي- عضو هيات علمی گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس
الهام بهزادي، لرنيک عيساخانيان-گروه ميکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرقدس 

Aspergillus، از گروه قارچ­های رشته ­ای مهمی است که انتشار جهانی داشته و به عنوان يک عامل عفونت ­زای فرصت ­طلب قارچی به شمار می ­رود. از 180 گونه­ ی شناخته شده­ ی اين قارچ، برخی سبب بروز حساسيت و يا عفونت­های مهاجم در انسان می ­شوند. مهم­ترين گونه­ های عفونت ­زا در انسان عبارتند از: Aspergillus fumigatus، Aspergillus flavus، Aspergillus terreus و Aspergillus niger.

فناوری PCR (Polymerase Chain Reaction) مهم­ترين روش تکثير اسيدهای نوکلئيک جهت تشخيص Aspergillus به­ شمار می­ آيد.

بررسی­ها نشان می­ دهند که در آسپرجيلوزيز مهاجم، شناسايي اسيدهای نوکلئيک مربوط به گونه­ های عفونت ­زای قارچ Aspergillus از طريق مطالعه­ ی بخش­های مختلف نمونه­ ی خون (سرم، پلاسما و خون کامل) انجام می­ گيرد؛ اما هنوز اتفاق نظری در مورد اين که کدام بخش از خون برای شناسايي DNA قارچ Aspergillus بهتر است، وجود ندارد. همچنين، از روش PCR برای بررسی نمونه ­های بدست آمده از مايعات حفرات برونش­ها و بافت­ها استفاده می­ گردد. البته شواهدی وجود دارد که نشان می­ دهد با استفاده از سرم خون می­ توان به­ صورت همزمان آزمون آنتی ­ژن را نيز بدون اضافه نمودن مواد ضد انعقاد انجام داد. از مواد ضد انعقاد می­ توان به سيترات سديم، EDTA و هپارين اشاره نمود که از بازدارنده­ های PCR به ­شمار می­ آيند.

در حال حاضر روش­های متعددی برای استخراج DNA وجود دارد. ديواره ­ی سلولی قارچ­ها يکی از بزرگ­ترين موانع برای استخراج DNA با کيفيت بالا می ­باشد. يکی از روش­های استخراج DNA استفاده از پروتکل­های ويژه ­ی هر موسسه يا شرکت است. علاوه بر اين، با استفاده از کيت­های تجاری و يا روش­های تجاری خودکار می ­توان به اين هدف دست يافت. روش­ های تجاری خودکار برای شناسايي DNA قارچی يک گزينه­ ی مهم به­ شمار می ­آيند؛ زيرا بدين طريق می­‌توان روش­های تشخيصی بالينی رايج را مدرن و پيشرفته نمود. بررسی­ها نشان می­ دهند که کارايي کيت­های تجاری برای استخراج DNA به ­طور چشمگيری از يکديگر متفاوتند. شکستن سريع سلول­های قارچی با استفاده از واکنشگرهای تخريب­ کننده ­ی ساختار مولکولی و تجزيه­ کننده­ ی بستر بخش­های مختلف سلول، کيفيت بالايي از DNA مربوط به گونه­ های مختلفی از قارچAspergillus  و ساير قارچ­های رشته­ ای را در اختيار می­ گذارد. نکته ­ی مهم آن که، پروتکل­های مختلفی برای استخراج DNA وجود دارد و همچنين چگونگی انجام آنها مانع از مقايسه­ ی روش­های مولکولی تشخيصي با يکديگر می­ شوند.

امروزه، استفاده از روش­های مولکولی برای تشخيص عوامل عفونت­ زای قارچی در نمونه­ های بالينی از اهميت زيادی برخوردار می­ باشد، زيرا تکنيک­های مزبور به عنوان روش­های اختصاصی و تشخيصی نهايی به­ کار گرفته مي­ شوند. بنابراين، برای دريافت پاسخ بهينه، می­ بايستی از پرايمرهايي استفاده کرد که گستره­ ی وسيعی از توالی­های نوکلئوتيدی قارچ­ها را در بر گرفته و بتوان به کمک آن اقدام به شناسايي گونه­ ي قارچی نيز نمود. پرايمرهای قارچ شمول، معطوف به بخش­های محافظت شده بوده که توالی­های خاص هر گونه را شامل می­ گردد. کمپلکس DNA ريبوزومی در قارچ­ها، رايج ­ترين بخش هدف به ­شمار مي­ آيد. اين کمپلکس در بر دارنده­ ی توالي­های محافظت شده و متغير بوده و در حال حاضر حجم بالایی از اطلاعات در مورد گستره­ ی وسيعی از جنس­ها و گونه ­های قارچی در پايگاه­های داده­ ها وجود دارد. ژن­های ميتوکندريايي کدکننده ­ی برخی از ژن­های RNA و سيتوکروم b نيز به عنوان پرايمرهای هدف مورد استفاده قرار گرفته ­اند. ژن­های هدف ميتوکندريايي به عنوان کپی­ های چندگانه در نظر گرفته می­ شوند، زيرا به ازای هر هسته در يک سلول چندين ميتوکندری وجود دارد.

در گذشته روش Nested PCR، به عنوان مهم­ترين روش اختصاصی برای شناسايي گونه­ های مختلف قارچ Aspergillus مورد استفاده قرار می­ گرفت، ولی به دليل نياز به باز نمودن لوله ­های واکنش، رفته رفته ارزش و اهميت خود را از دست داد؛ زيرا با باز کردن در لوله ­های واکنش، امکان آلودگی نمونه­ ی مورد مطالعه وجود داشته و از اين­رو، امروزه استفاده از روش­های Real-Time PCR جايگزين Nested PCR شده است.

تکنيک­های شناسايي بعد از تکثير، اطلاعات اختصاصی مربوط به جنس يا گونه را بدست می ­دهند، ولی در عين ­حال ميزان اختصاصی و حساس بودن نيز افزايش می ­يابد. روش­های تشخيصي Real-Time PCR خودکار، سريع و قابل تکرار می ­باشند.

معمولا حساسيت يک آزمون مولکولی از طريق بررسی رقت سريال عامل عفونت­ زا تعيين می ­گردد، اما اين کار در مورد Aspergillus spp. و ديگر قارچ­های رشته­ ای مشکل ­زا خواهد بود؛ چراکه تعيين رقت برای هيف­های قارچی بی ­معنا است. همچنين تهيه­ ی رقت سريال از کنيديوم و يا مولکول­های DNA (چه مولکول­های DNA ژنومی و چه مولکول­های DNA پلاسميدی) قارچ­های رشته ­ای روشهای مناسبی نيستند. در مورد حالت نخست، چون کنيديوم­ها روند زيستی مشابه با ساختار رويشی هيف­ها را از خود نشان نمی ­دهند، برای نمونه هيف­های قارچی برخلاف کنيديوم­ها قادر به تهاجم می­ باشند. در مورد حالت دوم، درجه­ ی خلوص مولکول­های DNA استخراج شده، مورد بررسی قرار نمي­ گيرد.

برای شناسايي بيش از يک گونه ­ی قارچی، می­بايستی مولکول­های DNA قارچی با روش ارزشيابی ميزان حساسيت مورد تجزيه و تحليل قرار گيرند. اگرچه، آزمون­های تعيين حساسيت مزبور از جهات بسياری گوناگون و متفاوتند، ولی در بسياری از روش­های گزارش شده 1 تا 10 قطعه از DNA به عنوان توالی هدف، مورد استفاده قرار می­ گيرند. البته، تنوع در محدوديت­های شناسايي اين امکان را به پژوهشگران می ­دهد تا بتوانند آزمون­های ياد شده را مقايسه نمايند.

از طرف ديگر، بايستی توجه داشت که تاکنون در آزمون­های بررسی ميزان حساسيت و اختصاصي بودن روش­های مولکولی مورد استفاده برای شناسايي قارچ­ها از تکنيک­ها و سنجش­ های استانداردی بهره گرفته نشده است. در حال حاضر، پرايمرهای هدف عموما” از منطبق سازی با توالی­های نوکلئوتيدی موجود در پايگاه­های داده ­ها نظير آنچه که در NCBI به پژوهشگران ارائه می­ گردد، ساخته می ­شود. اگرچه انجام چنين کاری الزامی به نظر می­ رسد، ولی چنين روندی در عرصه­ ی فعاليت­های پژوهشی ناکافی و ناقص ارزيابی می­ گردد. برای ساخت پرايمرهای مورد استفاده جهت شناسايي قارچ­های مورد مطالعه، می­بايستی آمپليکون مورد نظر توالی‌يابی شده و با استفاده از نرم افزارهای مربوطه نظير BLAST توالی­های هدف مورد مقايسه و ارزيابی قرار گيرند. علاوه بر اين، لازم است تا شباهت توالي­های هدف با توالي­های مشابه خود در موجودات زنده ­ی ديگر مورد ارزيابی قرار گرفته و مقايسه شوند. برای نمونه، در مورد قارچ Aspergillus، جنس­هايی که قرابت فيلوژنتيکی به اين قارچ دارند مانند Penicillium و Paecilomyces را می­ بايستی مورد توجه قرار داد.

اما نکته­ ی مثبتی که در حال حاضر می­ تواند روند کاربرد روش­های مولکولي را افزايش دهد، استفاده از Uracil-D-Glyculase است که مانع از بروز واکنش­های مثبت دروغين در شناسايي قارچ­ها می­ گردد. 

آنچه که حساس بودن روش PCR در شناسايي عوامل قارچی موجود در نمونه­ های بالينی را مورد ترديد قرار داده است، ويژگی بازدارندگی داروهای ضد قارچی برای PCR است، اما بايستی توجه داشت که با توجه به اين که امروزه برای بسياری از متخصصين ثابت شده است که مشکلات غيرقابل تغييری در استفاده از روش سنتی کشت قارچ­ها وجود داشته و نيز درستی و سرعت بالايي که در ارائه­ ی پاسخ بسياری از آزمون­های PCR مشاهده می­ شود، موجب شده تا استفاده از تکنيک­های مولکولی برای شناسايي عوامل عفونت ­زای ميکروبی در نمونه ­های بالينی به طور چشمگيری افزايش يابد. به ­علاوه، تکنيک ديگری که به ­تازگی در شناسايي عوامل عفونت­ زای ميکروبی در نمونه های بالينی و از جمله قارچ­ها در دست بررسی بوده و سرعت تشخيص بالايي را ارائه می­ دهد، فناوری Micoarray می ­باشد که در آينده­ ی نزديک در سرتاسر جهان از جايگاه ويژه­ ای برخوردار خواهد شد.

منابع:

1)Hope W.W., Walsh T.J., Denning D.W., Laboratory Diagnosis of invasive Aspergillosis, Lancet infectDis (2005):609-22

2)Wengenak N.L., Binnicker M., Fungal Molecular Diagnostics, Clin Chest Med 30 (2009) 391-408

3)http://www.aspergillus.org.uk/, 2010-04-29

4)Singleton, P., Sainsbury, D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, John Wiley and Sons, edition 3r2002