الکترو کمی لومینسانس

نوشته شده توسط مدیر سایت on . Posted in هورمون شناسی

 وحید ظریفیان- آزمایشگاه پردیس مشهد

دکتر عبدالرضا وارسته- آزمایشگاه پردیس مشهد و مرکز آموزش عالی علوم پزشکی وارستگان مشهد و مرکز تحقیقات ایمنولوژی مشهد

مقدمه

روش‌های سنجش مولکولها در علوم زیستی، یکی از مهم‌ترین شاخه‌های تحقیقاتی به‌شمار می‌آید. گاه نقاط عطفی در این میان پدید می‌آید و روش جدیدی مطرح می‌گردد و تا رسیدن به نقطه عطف دیگر و روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلی ادامه می‌یابد. بدیهی است که هر روش محاسن و معایب خاص خود را داشته و با توجه به این ویژگی‌ها، گسترش یافته و یا محدود می‌شود. گاهی روش‌های جدید الزاماً جایگزین روش‌های قبلی نیستند، بلکه به موازات آنها از محدودیت‌های موجود می‌کاهند.

در ابتدای نیمه دوم قرن بیستم، محصول سیستم ایمنی همورال یعنی آنتی‌بادی‌ها یکی از نقاط عطف مورد بحث را بوجود آوردند. آنتی‌بادی‌ها با اتصال اختصاصی به مولکولی که بر ضد آن تهیه شده‌اند، به عنوان ابزاری برای سنجش‌های اختصاصی و سریع در اختیار محققان قرار گرفتند. روش‌هایی که از آنتی‌بادی‌ها به عنوان شناساگر بهره می‌گیرند، روش‌های سنجش ایمنی (Immunoassay) نام دارند.

شناسایی یک مولکول خاص، اولین مرحله در این نوع سنجش‌ها محسوب می‌شود. این عمل توسط یک آنتی‌بادی اختصاصی انجام می‌پذیرد. به‌عبارتی جزء لاینفک هر سنجش ایمنی میان کنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است. یکی از انواع طبقه‌بندی سنجش‌های ایمنی بر اساس نوع ماده نشاندار بنا شده است. به عنوان مثال: Radioimmunoassay،Enzyme immunoassay،Immunofluorescence assay و ... که در این میان روش سنجش ایمنی رادیواکتیو دارای قدمت بیشتری نسبت به سایر روش‌ها می‌باشد.

در روش سنجش ایمنی رادیواکتیو هر کدام از دو جزء آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی را می‌توان با ماده رادیواکتیو نشاندار ساخت. استفاده از ماده رادیواکتیو به عنوان نشانگر، باعث ایجاد معایبی از جمله خطر تشعشع و نیمه عمر کوتاه کیت‌ها شده است.

روش سنجش ایمنی که بعد از روش رادیواکتیو ابداع گردید روش سنجش‌های ایمنی آنزیمی (EIA) است که مانند روش قبل اساس آنها بر واکنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی می‌باشد، با این تفاوت که جهت ردیابی واکنش مذکور بجای عناصر رادیواکتیو از آنزیم و واکنش آنزیمی استفاده می‌شود. شایان ذکر است که طیف متنوعی از تکنیک‌های غیررادیواکتیو به‌عنوان روش‌های جانشین تشخیصی در سنجش‌های ایمنی طراحی شده‌اند.

تکنولوژيی که در سال‌های اخیر طراحی شده است به نام کمی لومینسانس (CL) یا لومینسانس (L) معروف است که محصول نهایی قابل سنجش آن نور می‌باشد. كمی لومینسانس به تابش نور از محصول تهییج شده یك واكنش شیمیایی، زمانی كه به سطح پایه برمی‌گردد، اطلاق می‌شود. مثال بسیار ساده برای این واکنش آتش گرفتن یک چوب کبریت می‌باشد. در این فرآیند گوگرد در طی یک واکنش شیمیایی، اکسید شده و تولید نور می‌کند. با تلفیق یك واكنش كمی لومینسانس و یك واكنش ایمونولوژیك می‌توان با اندازه‌گیری مقدار نور تابش یافته، غلظت مولکول‌ها را تعیین كرد.

اصول پایه و تعریف کمی لومینسانس

وقتی یک الکترون از سطح تهییج شده یا بالاتر به سطح پایین‌تر انرژی می‌رسد و انرژی خود را به صورت نور متصاعد می‌کند، واکنش را به نام لومینسانس می‌شناسیم. انواع متعددی از پدیده لومینسانس شناخته شده‌اند که شامل فلورسانس، فسفرسانس و کمی لومینسانس می‌باشند. پدیده کمی لومینسانس از سایر پدیده‌های لومینسانس متفاوت است و در آن واکنش شیمیایی یا الکتروشیمیایی (و نه پدیده فوتولومینسانس) باعث تهییج می‌شود، ولی حاصل این تهییج مشابه فلورسنس بوده و در حین بازگشت الکترون به سطح پایه انرژی، نور منتشر می‌شود.

همانطور که قبلاً ذکر گردید تا رسیدن به نقطه عطف دیگر و روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبل ادامه خواهد داشت، که طی چند سال گذشته در جهت بهبود کمی لومینسانس روش الكتروكمی لومینسانس ابداع شده است.

الكتروكمی لومینسانس نوعی از كمی لومینسانس است كه در آن واكنشی كه به تولید نور می‌انجامد با جریان الكتریكی آغاز و با قطع آن خاتمه می‌یابد و نور تولید شده در این روش تنها در محل الكترود ایجادگر جریان الكتریكی به وجود می‌آید. كنترل زمان تابش نور، مشكل تداخل بیش از حد نور تابش شده از نمونه های مجاور را رفع می‌كند و همچنین كنترل محل تابش نور (تنها در سطح الكترود) باعث می‌شود تا بتوان تمامی نور تولید شده از نمونه را در محلی بسیار نزدیك به دستگاه دتكتور متمركز كرد. این موضوع، با افزایش نسبت سیگنال به نویز (نور زمینه) دقت را بالا برده و همچنین با تمركز نور بر سطح دتكتور، حساسیت را تا حد بسیار زیادی افزایش می‌دهد. در حال حاضر، سایر روش‌های ایمونواسی فاقد چنین حساسیتی می‌باشند. همچنین با كنترل محل تابش نور می‌توان نور تابش یافته از بیش از یك واكنش ایمونولوژیك در یك نمونه را همزمان در محل‌های مختلف قابل اندازه‌گیری كرد و بدین ترتیب می‌توان غلظت چند ماده را در نمونه به صورت همزمان تعیین كرد. از مزایای دیگر این روش امكان انجام آزمایش در زمانی بسیار كوتاه است.

اصول روش الکتروکمی لومینسانس(ECL)

الکتروکمی لومینسانس فرایندی است که با واسطه مولکولهای متعددی از جمله ترکیبات روتنیم [1]، اسمیم [2]، رنیم [3] و یا دیگر عناصر شناخته شده رخ می‌دهد. فرایند الکتروکمی لومینسانس باعث تولید پیش‌سازهای پایدار در سطح الکترود می‌شود که محصول نهایی این واکنش تولید نور است.

در مثالی که در این مقاله توضیح داده می‌شود ترکیبی به نام روتنـیوم تریس بای پیریدیل « +2[bpy3)RU )] » به همـراه ماده تریپـروپیلامـین (TPA) استفاده می‌شود. در روش‌های آزمایشـگاهی، از اسـتر ان- هیدروکسی سوکسیـنیمید (NHS) روتنیوم استفاده می‌شود، چرا که راحت‌تر به پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و هاپتن‌ها متصل می‌شود (طیف وسیعی از آنالیت‌ها را در بر می‌گیرد).

پایه و اساس ECL در استفاده از کمپلکس روتنیوم تریس [4] و تریپروپیلامین (TPA)می‌باشد که محصول نهایی به صورت نور قابل اندازه‌گیری است. آغاز واکنش توسط جریان الکتریکی بوده که در پایان منجر به تولید نور از کمپلکس روتنیوم تریس خواهد شد. در این مرحله ولتاژی الکتریکی به کمپلکس ایمنولوژیک روتنیوم تریس اعمال می‌شود که این کمپلکس به استرپتوآویدین پوشیده شده در سطح میکروپارتیکل‌ها متصل شده است. استفاده از واکنش الکتریکی از مزایای این روش می‌باشد که می‌توان دقیقاً کل واکنش را تحت کنترل قرار داد.

اجزاء دخیل در یک روش ECL

برای درک بهتر مطلب، به توضیح اجزاء درگیر در یک واکنش ECL خواهیم پرداخت. این اجزاء شامل استرپتوآویدین [5]، بیوتین [6]، آنالیت (یا آنتی‌ژن)، آنتی‌بادی، میکروپارتیکل [7]، روتنیوم [8] و تریپلوپیلامین [9] می‌باشند.

در یک نمونه مورد آزمایش، آنالیت مجهول ممکن است آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی باشد. چنانچه فرض بر این باشد که آنالیت مجهول آنتی‌ژن است، روتنیوم بر روی آنتی‌بادی متصل (کونژوگه) می‌شود که توانایی اتصال به آنتی‌ژن مجهول را داشته و از طرفی بیوتین نیز بر روی آنتی‌بادی دیگری سوار (کونژوگه) می‌شود که توانایی اتصال به اپی‌توپ دیگر آنتی‌ژن مجهول را خواهد داشت که به آن آنتی‌بادی بایوتینه شده گفته می‌شود. بیوتین و استرپتوآویدین میل شدیدی جهت اتصال به یکدیگر دارند. میکروپارتیکل‌هایی که سطح آنها از استرپتوآویدین پوشیده شده است، به واکنش اضافه می‌شود. در مدت زمان انکوباسیون که این مواد در کنار یکدیگر قرار گرفته و به هم متصل می‌شوند، کمپلکسی تشکیل می‌شود که در یک انتها میکروپارتیکل‌ها و در انتهای دیگر روتنیوم قرار دارد. جهت تثبیت این کمپلکس از میدان مغناطیسی استفاده شده که باعث اتصال میکروپارتیکل‌ها به سطح جامد فلزی خواهد شد. بعد از تثبیت، واکنش بین تریپلوپیلامین (که در حقیقت نقش یک کاتالیزور را داشته) و روتنیوم (که نقش منتشر کننده نور را دارد) طی اعمال یک ولتاژ الکتریکی آغاز می‌شود که این واکنش در انتها منجر به تولید نور می‌شود. نور حاصله را می‌توان با استفاده از یک تقویت‌کننده نور (فتومولتی پلایر) به یک آشکارساز (Detector) رسانید و میزان فوتون‌های ساطع شـده را اندازه‌گیری کرد. با استفاده از استانداردهای از پیش تعیـین شده برای دستگاه می‌توان به میزان آنالیـت موردنظر با دقتی بین 18- 10 تا 12-10 پی برد.            

واکنش ECL در سطح الکترون

همانطور که قبلاً ذکر شد در واکنش الکتروکمی لومینسانس که منجر به تولید نور می‌شود، دو ماده روتنیوم و تریپلوپلامین دخیل هستند. این دو ماده تا زمانی که ولتاژ به آنها اعمال نشود پایدار خواهند بود. واکنش این دو ماده درتکنولوژی ECL بر روی سطح الکترودهایی از جنس پلاتین یا طلا صورت می‌گیرد. اعمال ولتاژ برق بر سطح الکترود باعث شروع واکنش خواهد شد و تریپلوپلامین (TPA) اکسیده شده و یک الکترون از دست می‌دهد، در نتیجه به فرم قبل از رادیکال آزاد تبدیل و سپس با از دست دادن یک اتم هیدروژن (H+) به شکل رادیکال آزاد TPA در خواهد آمد.

کمپلکس روتنیوم نیز در اثر اعمال ولتاژ یک الکترون ازدست داده و اکسیده شده و به فرم کاتیون روتنیوم (+RU) تبدیل می‌شود. این یون روتنیوم در دومین واکنش یک الکترون از کاتیون آزاد TPA گرفته و سپس جهت رسیدن به حالت پایدار نور از خود ساطع می‌نماید.

واکنش TPA با یون روتنیوم در اثر یک انتقال انرژی صورت می‌گیرد که در این حالت یون روتنیوم ناپایدار بوده و با انتشار فوتون در طول موج 620 نانومتر به حالت پایه خواهد رسید. بعد از رسیدن یون روتنیوم به حالت پایدار، این چرخه می‌تواند دوباره تکرار شود. حالت احیاء شدن یون TPA نیز طی پروسه‌ای انجام خواهد شد که تأثیری روی فرایند کمی لومینسانس نخواهد داشت. برای تداوم واکنش، غلظت TPA بایستی بیش از مقدار مورد نیاز باشد. این واکنش به وسیله میزان حضور TPA و مقدار کمپلکس روتنیوم کنترل می‌شود.

در مدت زمان اندازه گیری، TPA مصرف شده و کمپلکس روتنیوم به طور مداوم تولید می‌شود. این بدان معنی است که کمپلکس روتنیوم در طول پروسه اندازه‌گیری می‌تواند نور زیادی تولید بنماید که نشان‌دهنده تأثیر تقویت ذاتی بوده و حساسیت این تکنولوژی را نیز بیان می‌نماید. به‌ عبارتی دیگر، تعداد زیادی فوتون می‌تواند در نتیجه یک کمپلکس آنتی ژن- آنتی‌بادی ایجاد شود.

مدت زمان ایجاد سیگنال در ECL

زمانی که ولتاژ به الکترود اعمال می‌شود، در یک بازه زمانی کوتاه فوتون‌های نوری ایجاد شده و به اوج می‌رسد که می‌تواند به عنوان یک سیگنال در ECL شناسایی شود.

سلولهای اندازه‌گیری در ECL

هسته دستگاه ECL تعدادی کانال با ویژگی‌های خاص هستند که به نام سلول اندازه‌گیری خوانده می‌شوند. این سلول‌ها به‌گونه‌ای طراحی شده‌اند که جریان از آنها عبور می‌نماید. اساساً در سلول، اندازه‌گیری درسه مرحله به شرح ذیل صورت می‌گیرد:

1-   اتصال / رهایی

با استفاده از میدان مغناطیسی کمپلکس میکرو پارتیكل‌ها [10] و استرپتوآویدین که با آنتی‌ژن و آنتی‌بادی متصل شده‌اند، در سطح الکترود به صورت یکنواخت پخش می‌شوند. از سیستمPro Cell [11]   (بافر شستشو) جهت شستن ذرات پارتیکل‌های اضافی و معرف‌ها و مواد زائد دیگر استفاده می‌شود.

2-   انجام واکنش ECL

میدان مغناطیسی قطع شده و ولتاژ از طریق الکترودها به کمپلکس میکروپارتیکل‌ها و آنتی‌ژن و آنتی‌بادی منتقل می‌شوند و واکنش کمی‌لومینسانس آغاز می‌گردد. نور منتشر شده با فتو مولتی پلایر اندازه‌گیری شده و سپس سیستم از سیگنال‌های ایجاد شده جهت محاسبه میزان آنالیت مورد نظر استفاده می‌نماید.

3- آزادی میکروپارتیکل‌ها و تمیز کردن سلول

پس از اتمام اندازه‌گیری میزان فوتون رها شده، سطح الکترودها با محلول مخصوص (Clean Cell) شستشو داده شده و سطح سلول‌های اندازه‌گیری بازسازی می‌شوند و سلول برای اندازه‌گیری مجدد آماده می‌شود.

مزایای استفاده ازECL

الکترو کمی‌لومینسانس تکنولوژی جدیدی است که دارای مزایایی نسبت به تکنیک‌های تشخیصی دیگر می‌باشد، از جمله این مزایا می‌توان موارد ذیل را ذکر نمود:

1-   قابلیت اتوماسیون کامل دستگاه که خطای تکنیکی را کاملاً حذف می‌نماید.

2-   دارای معرف غیر ایزوتوپی بسیار پایدار و با کاربرد آسان می‌باشد.

3-   حساسیت بالا جهت اندازه‌گیری آنالیت‌ها با مقادیر بسیارکم و همچنین در مدت زمان کوتاه.

4-   سنجش با کیفیت بالا

5-   برگشت سریع و آماده شدن برای سنجش دیگر

6-   قابلیت تشخیص همه آنالیت‌ها با استفاده از این تکنیک و در یک نوع فاز جامد (عدم استفاده از چاهک مخصوصی برای هر تست)

7-   با توجه به عملکرد دستگاه، قدرت تکرارپذیری بسیار بالا و کاهش مصرف معرف‌ها و در نتیجه کاهش هزینه‌ها و کاهش زمان را می‌توان از ویژگی‌های این سیستم بیان نمود.

محدودیت‌های استفاده از ECL

همان طور که قبلاً اشاره شد، هر روشی علاوه بر مزایا دارای معایب و محدودیت‌هایی نیز می‌باشد که این محدودیت‌ها عبارتند از:

1-   بسته بودن سیستم ( دراین روش بایستی حتماً از دستگاه و کیت‌ها و محلول‌ها و همچنین سرسمپلر و چاهک‌های مخصوصی استفاده شود که کاملاً انحصاری و در اختیار یک شرکت مشخص می‌باشد)

2-   هزینه قابل توجه دستگاه و همچنین کیت‌ها و محلولهای آن

روش‌های انجام تست در ECL

چهار روش در سیستم الکتروکمی لومینسانس وجود دارد:

1-   روش رقابتی جهت اندازه‌ گیری آنالیت‌های کوچک

2-   روش ساندویچ (یک مرحله‌ای و دو مرحله‌ای) جهت اندازه‌گیری آنالیت‌های بزرگ

3-   روش پل زدن (Bridging) برای تشخیص آنتی‌بادی‌ها

4-   روش سنجش پروب‌های نوکلوئیک اسید

روش رقابتی

از این روش برای اندازه‌ گیری مولکول‌های کوچک مثل FT3 استفاده می‌شود .

1-   در اولین قدم سرم و آنتی‌بادی ضد FT3 که با کمپلکس روتنیوم نشاندار شده است در داخل چاهک اضافه می‌شود.

2-   در مرحله دوم FT3 بیوتینه شده و استرپتوآویدین که به میکروپارتیکل‌ها متصل شده است، اضافه می‌گردد. FT3 بیوتینه شده و FT3 آزاد موجود در سرم جهت اتصال با آنتی‌بادی ضد FT3 که با کمپلکس روتنیوم نشاندار شده است رقابت می‌نمایند. هرچه میزان FT3 آزاد بیشتر باشد، FT3 بیوتینه کمتری به آنتی‌بادی ضد FT3 متصل می‌شود و در نتیجه میزان کمتری از آنها به میکروپارتیکل‌ها متصل خواهند شد و بالعکس.

3-  پس از انکوباسیون دوم مخلوط واکنش شامل کمپلکس ایمنی (FT3 متصل‌شده به آنتی‌بادی اختصاصی خود) به سلول اندازه‌گیری منتقل می‌شود. کمپلکس ایمنی با واسطه میکروپارتیکل به سطح الکترود مغناطیسی متصل می‌شود و نمونه‌ها و معرف‌های اضافی توسط محلول شستشو خارج می‌شوند.

4-   در روش ECL، کونژوگه روتنیوم پایه و اساس کمی لومینسانس است که با تحریک الکتریکی تولید نور می‌نمایند. در این روش رقابتی میزان نور تولید شده ارتباط معکوس با غلظت FT3 موجود در نمونه دارد. ارزیابی و محاسبه غلظت مولکول از طریق منحنی کالیبراسیون که بواسطه غلظت استانداردها رسم شده است، انجام می‌گردد.

روش ساندویچ برای اندازه‌گیری آنالیت‌های پروتئینی مانند هورمون TSH بکار می‌رود.

1-   در مرحله اول نمونه با آنتی‌بادی بیوتینه TSH و آنتی‌بادی اختصاصی TSH که با روتنیوم نشاندار شده است، مخلوط می‌گردد. در زمان انکوباسیون، اول آنتی‌بادی اختصاصی با TSHموجود در نمونه اتصال پیدا می‌کند.

2-   در مرحله دوم استرپتوآویدین متصل به میکروپارتیکل‌ها اضافه می‌شود. در انکوباسیون دوم آنتی‌بادی بیوتینه به استرپتوآویدین که در سطح میکروپارتیکل‌ها پوشیده شده متصل می‌گردد.

3-   پس از انکوباسیون دوم مخلوط واکنش شامل کمپلکس ایمنی به سلول اندازه‌گیری دستگاه ECL منتقل می‌شود. کمپلکس ایمنی بر روی الکترود مغناطیسی قرار گرفته و نمونه‌ها و معرف‌های اضافی توسط محلول شستشو خارج می‌گردند. سپس واکنش الکتروکمی لومینسانس که باعث ایجاد نور می‌شود در سطح الکترود مغناطیسی انجام می‌پذیرد.

4-   در این مرحله میزان نور تولید شده با غلظت TSH موجود در نمونه رابطه مستقیم دارد. ارزیابی و محاسبه غلظت مولکول با استفاده از منحنی کالیبراسیون که آن نیز بواسطه غلظت استانداردها رسم شده است، توسط دستگاه به صورت خودکار انجام می‌گردد.

روش پل زدن (Bridging)

در این روش از دو نوع آنتی‌ژن کونژگه شده (کونژوگه با بیوتین و کونژوگه با روتنیوم) استفاده می‌شود. این روش شبیه به روش ساندویچ بوده با این تفاوت که در این روش آنتی‌بادی مورد سنجش می‌باشد ( مانند IgG ،IgM وIgA ).

1-   در اولین گام، آنتی‌بادی مورد هدف در سرم به آنتی‌ژن نشاندار متصل شده و کمپلکس ایمنی تشکیل می‌دهند.

2-   در مرحله دوم این کمپلکس ایمنی به استرپتوآویدین پوشیده شده در سطح میکروپلیت‌ها متصل می‌شود.

3-   پس از انکوباسیون دوم مخلوط واکنش شامل کمپلکس ایمنی به سلول اندازه‌گیری دستگاه ECL منتقل می‌شود. کمپلکس ایمنی بر روی الکترود مغناطیسی متصل شده و نمونه‌ها و معرف‌های اضافی توسط محلول شستشو خارج می‌گردند. سپس واکنش ECL در سطح الکترود که باعث ایجاد نور می‌شود، صورت می‌پذیرد.

4-   در این مرحله میزان نور تولید شده با مقدار مولکول موجود در نمونه رابطه مستقیم دارد. در روشECL ارزیابی و محاسبه غلظت مولکول از طریق منحنی کالیبراسیون انجام شده که آن نیز بواسطه غلظت استانداردها رسم شده است.

نتیجه‌گیری

روش الکتروکمی لومینسانس را با توجه به مزایایی که قبلاً ذکر شده از جمله دقت، صحت، قابلیت سنجش چند مولکول متفاوت به طور همزمان در نمونه مورد آزمایش، جوابدهی سریع حتی برای تست‌های فوق تخصصی و عدم اتلاف وقت و در نتیجه رضایتمندی هر چه بیشتر بیماران و پزشکان محترم که هدف تمامی همکاران می‌باشد را در بر داشته است، می‌توان به عنوان روشی که نسبت به سایر روش‌ها ارجحیت دارد، در نظر گرفت. با اینکه روش کمی‌لومینسانس نیز یک روش نوین در سنجش مولکول‌ها می‌باشد، ولی به این دلیل که در این مقاله جایگاه مطرح نمودن این بحث نمی‌باشد، جایگاه خود را سریعاً به الکتروکمی لومینسانس تغییر داده است و چنانچه آزمایشگاهی شرایط انجام تست به روش الکتروکمی لومینسانس را داشته و همچنین کیفیت در پاسخ‌دهی به بیماران را در سرلوحه عملکرد خود قرار داده باشد، مطمئناً این روش را به سایر روش‌ها ترجیح خواهد داد.

منابع:

-1 k. Imai, A. Nishitani, H. Akimoto,Y. Tsukamoto, J. Biolumin. Chemilumin. 4 (1989)500-504

-2 S. Kobayashi, K. Imai, Anal. Chem. 52 (1980)424-427

-3Yu. H., 1996b.Enhancing immune-electrochemiluminescence (IECL) for sensitive bacterial detection. J. Immunol. Metods 192(1-2), 63-71

-4Yu. H., 1998a. Comparitives studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescenc immunoassays. J. Immunol, Methods 218,1-8.

[1] Ruthenium

[2]Osmium

[3]Rhenium

[4]Ruthenium tris

[5]Streptavidin

[6]Biotin

[7]Microparticle

[8]Ruthenium

[9]Tripropylamine

[10] برای تثبیت واکنشگرها در سطح الکترود (که می‌تواند آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی باند شده به « +2[ bpy3)Ru)] » باشد) از میکروپارتیکل‌های (ریز ذره‌های) پارامغناطیس از جنس استرپتاویدین استفاده می‌کنند که آنتی‌ژن یا آنتی بادی‌ها می‌توانند با واسطه بیوتین به آنها اتصال یابند.

[11] بافری مملو از تریپلوپیلامین می‌باشد که جهت حذف مواد اضافی به کار می‌رود.