تشخيص توبركولوز با استفاده از روش‌هاي تكثير اسيدنوكلئيك

نوشته شده توسط مدیر سایت on . Posted in تشخیص مولکولی

دكتر مهران ايزدي- بورد تخصصي بيماري‌هاي عفوني
دكتر حسام‌الدين بحريني- دكتراي علوم آزمايشگاه 
اميد معصومي هزاوه- كارشناس ارشد علوم آزمايشگاهي

شناسائي سريع بيماران مبتلا به توبركولوز اهميت ويژه‌اي دركنترل اين بيماری دارد. روشهاي مبتني بر NAA) Nucleic Acid Amplification) بويژه PCR به دليل سرعت، حساسيت و ويژگي زياد بطور وسيعي براي شناسايي مايكوباكتريوم توبركولوزيس درنمونه‌هاي باليني استفاده مي‌شوند، اما محدوديتها و الزاماتي در تشخيص آزمايشگاهي و همچنين درخواست و تفسير آزمايش وجود دارند كه مي‌توانند بر صحت نتايج آزمايشگاهي و تشخيص باليني مؤثر باشند.

آزمايشگاه و روش‌هاي NAA :

هرچند مطالعات متعدد ويژگي‌هاي عملكردي روشهاي NAA را در تشخيص توبركولوز مشخص كرده‌اند، اما مطالعاتي كه عملكرد آزمايشگاهي اين روش‌ها را در «شرايط تشخيص روتين» نشان دهند، اندك مي‌باشند. نتايج مطالعات انجام شده توسط Noordhook و همكاران در سال‌هاي 1994 و 1996 نگران‌كننده بود. آنها نشان دادند كه اختلاف قابل توجهي درتوانائي آزمايشگاهها براي شناسائي مايكوباكتريوم توبركولوزيس در نمونه‌هاي blind وجود دارد.[*]

در اولين مطالعه، هفت آزمايشگاه كه در انجام PCR مايكوباكتريوم تجربه زيادي داشتند شركت كردند، به هر آزمايشگاه 200 نمونه مثبت و منفي ارسال شد. ژن هدف IS6110 بود. موارد مثبت كاذب از %3 تا %22 متغير و دريك آزمايشگاه به %77 رسيد! حساسيت روش‌ها براي نمونه‌هايي كه 1000 باسيل داشتند، بسيار متفاوت و از %2 تا %90 متغير بود.

در مطالعه دوم 30 آزمايشگاه از 18 كشور شركت داشتند و به هر يك 20 نمونه مثبت و منفي ارسال شد. محدوديتي از نظر پروتكل تكثير، متد و ماهيت ژن وجود نداشت. در اين مطالعه فقط 5 آزمايشگاه (%16) نمونه‌هاي مثبت و منفي را بطور صحيح شناسايي كردند و تقريباً نيمي از آزمايشگاهها نتايج مثبت كاذب داشتند. در مورد حساسيت روش‌ها نيز فقط 7 آزمايشگاه توانستند تمام نمونه‌هاي مثبت را شناسايي كنند.

سومين مطالعه توسط CDC آمريكا در سال 1997 با ارسال نمونه به آزمايشگاههاي داوطلب انجام شد.

نكته قابل تأمل در مطالعات Noordhook باتجربه بودن آزمايشگاههاي شركت‌كننده در انجام تست‌هاي NAA و همچنين استفاده از كنترل‌هاي مثبت و منفي درمراحل تكثير و آشكارسازي دراكثريت موارد بود.

در ذيل مروري بر علل نتايج مثبت و منفي كاذب درتست‌هاي تكثير اسيد نوكلئيك مايكوباكتريوم توبركولوزيس خواهيم داشت.

علل نتايج مثبت كاذب:

1- Cross Contamination : نتايج مثبت كاذب در آزمايشگاههاي كشت و مولكولار مايكوباكتريولوژي يك مشكل شناخته شده است و معمولاً به دليل cross contamination در هنگام آماده‌سازي نمونه‌ها اتفاق مي‌افتد. اين موضوع ناشي از انتقال باسيل‌ها از نمونه‌هاي مثبت و بافرها و ريجنت‌هاي آلوده و يا وسايل آلوده به نمونه‌هاي منفي در طي فرآيند هضم و آلودگي‌زدايي نمونه مي‌باشد.

2- آلودگي مواد و تجهيزات با Amplicon

3- باسيل‌هاي كشته شده: وجود باسيل‌هاي كشته شده در طي درمان و يا بعد از اتمام درمان ضد توبركولوزي مي‌تواند از علل واكنش‌هاي مثبت كاذب باشد. واكنش مثبت PCR در نمونه‌هاي ريوي حتي 2/5 سال پس از اتمام درمان مشاهده شده است.

برونكوسكوپ‌هاي استريل اما آلوده به DNA قابل تكثير مايكوباكتريوم نيز مي‌توانند سبب نتايج مثبت كاذب شوند. در يك بررسي، DNA قابل تكثير انسان و مايكوباكتريوم توبركولوزيس به ترتيب از %20 و %3/6 برونكوسكوپ‌هاي استريل جدا شده است.

4- ساير عوامل: مواردی از قبيل برچسب‌گذاري اشتباه روي نمونه‌ها، نمونه‌گذاري نامناسب درحفرات آگار كه سبب پخش DNA در طي الكتروفورز گردد و اشتباه در خواندن نتايج، قابل ذكر هستند.

علل نتايج منفي كاذب:

     می توان به وجود مهاركننده‌ها در نمونه‌های بالينی‏، ليز ناكامل نمونه و از دست دادن DNA در فرآيند تخليص اشاره كرد. مواردی چون كيفيت نامناسب و حجم ناكافی نمونه، RCF پايين سانتريفوژ نيز از عوامل مؤثر در نتايج منفی كاذب روش‌های كشت و مولكولار می باشند.

     راهكارهاي جلوگيري از واكنش‌هاي مثبت كاذب:

    الف- براي جلوگيري از cross contamination رعايت نكات ذيل توصيه مي‌شود:

  •       هود ميكروبيولوژيك حداقل به مدت 5 دقيقه قبل از شروع بكار روشن شده باشد.
  •       درفضاي داخلي هود، سطوح جانبي و كار با ضدعفوني كننده مناسب ضدعفونی گردند.
  •       از گذاشتن مواد و وسايل غير ضروری در داخل هود خودداري گردد.
  •       مطمئن شويد روی قسمت‌هاي مشبك جلويي و عقبي هود وسيله‌ای قرار نگرفته باشد.
  •       پارچه جاذب‌الرطوبه كه آغشته به مواد ضدعفونی كننده مانند فنل 5% باشد و در زير آن يك ورقه پلاستيكي قرار گرفته باشد در روي سطوح كار قرار داده شود، اما روي سطوح مشبك هود قرار نگيرد. اين كار نه تنها احتمال تشكيل آئروسل را در زمان ريختن مواد روي سطح كار كاهش مي‌دهد بلكه تميز كردن سطح كار را نيز سرعت مي‌بخشد. در پايان كار پارچه و پلاستيك جمع‌آوري و اتوكلاو شوند. تجهيزات آئروسل‌زا مانند vortex mixer درقسمت عقب هود و نزديك به قسمت مشبك قرار داده شوند.
  •       اقلام حجيم مانند ظرف پي‌پت‌ها، كيسه‌ها و فلاسك‌هاي جمع‌آوري در يك طرف قرار داده شوند.
  •       چيدمان وسايل و مواد به گونه‌اي باشند كه جريان كار از ناحيه تميز بسوي ناحيه آلوده باشد تا حركت اجسام آلوده از روي اجسام تميز محدود شود.
  •       براي عملكرد درست هود جريان هوا بايد حالت پايدار داشته باشد، از اين رو قبل از كار روي نمونه‌ها، دست‌ها در داخل هود به مدت يك دقيقه بی حركت باشند.
  •       محل انجام كار روي نمونه‌ها حداقل 4 اينچ از قسمت مشبك جلويي فاصله داشته باشد. بازوها را اندكي بالا نگه داريد تا هواي اتاق به داخل قسمت مشبك وارد شود.
  •       ظرف جمع‌آوري وسايل و مواد دورريختني بصورت افقي قرار داده شود و حاوي ماده ضدعفوني‌كننده مناسب (فنل 5%) باشد.
  •  برای کاهش احتمال آلودگي، مواد پاكيزه را حداقل 12 سانتي‌متر از فعاليت‌هاي آئروسل‌زا دور نگه داريد.
  •  درب لوله‌ها و بطري‌هاي باز را هرچه سريعتر ببنديد.
  •  استفاده از شعله باز و حجيم به دليل برهم زدن جريان هواي هود مناسب نمي‌باشد و استفاده از «hooded Bunsen flame» يا «كوره‌هاي الكتريكي كوچك لوله‌اي‌شكل» توصيه مي‌شود.
  •  سطوح خارجي تمام وسايل و ظروف قبل از خروج از هود ضدعفونی گردند.
  •  در پايان كار روزانه سطوح داخلي هود، بجز سطح فوقاني، ضد عفونی گردند.
  •       براي هر نمونه از يك پي‌پت اختصاصی برای ريختن محلول‌ها استفاده شود.
  •       براي ريختن محلول‌های مشترك مانند بافرها، براي هر نمونه از يك ظرف جداگانه استفاده شود.
  • .برداشتن و گذاشتن درب لوله‌هاي حاوي نمونه به‌گونه‌اي باشد كه دريك زمان فقط درب يك لوله      
  •       درمرحله هضم و آلودگی زدايي و بعد از سانتريفوژ به دور ريختن مايع روئي هر نمونه دريك ظرف waste جداگانه انجام شود.
  •       نمونه‌هايي كه احتمال مثبت بودن آنها وجود دارد (اسمير آنها مثبت است و يا بيماراني كه قبلاً مبتلا به TB بوده‌اند) به فاصله يك رديف از ساير نمونه‌ها جدا نگهداري شوند.

ب - ممانعت از آلودگی با Amplicon :

رعايت مقررات در آزمايشگاههاي NAA، مانند جدا بودن فضا، تجهيزات، unidirectional work flow، بكارگيري مواد شيميائي غيرفعال‌كننده amplicon و ... لازم است. سيستم‌هاي بسته‌اي مانند Real Time PCR دركاهش آلودگي بسيار مؤثر مي‌باشند.

مطالعه انجام شده توسط CDC در سال 1997 نشان داد كه واكنش‌هاي مثبت كاذب عمدتاً به آزمايشگاههايی مربوط می شد كه از هود مشترك جهت كشت و اسمير و NAA مايكوباكتريوم استفاده مي‌كردند. همچنين از unidirectional work flow بی اطلاع بودند يا به آن عمل نمی كردند.

ج- كنترل برونكوسكوپ‌های استريل:

قبل از برونكوسكوپي لوله برونكوسكوپ با 5 ميلي‌ليتر نرمال سالين استريل شستشو داده شود و مايع حاصله نگهداری شود. درصورت مثبت شدن تست NAA، نرمال سالين مذكور از نظر وجود DNA مايكوباكتريوم توبركولوزيس بررسي شود.

به دليل فقدان يك استاندارد بين‌المللي براي تست‌هاي NAA مايكوباكتريوم توبركولوزيس، كنترل كيفي در تمام مراحل توصيه شده است:

•1- استفاده از كنترل‌های مثبت و منفی در هر نوبت كاری و در تمام مراحل لازم است.

•2- بكارگيري Internal Control : هرچند متدهای گوناگونی برای مونيتورينگ مهاركننده‌های Taq پلي‌مراز در نمونه‌هاي باليني توصيف شده است كه می توان به تكثير همزمان DNA غيرتوبركولوزي درخلط تخليص شده يا اضافه كردن DNA كنترل با طراحي ويژه كه قادر است از پرايمرهاي مشابه سكانس هدف استفاده كند اشاره كرد، اما بكارگيري نوعي Internal Control كه امكان مونيتورينگ چهار مرحله آماده‌سازی نمونه (هضم و آلودگی زدايی)، تخليص، تكثير DNA و آشكارسازي محصول را فراهم كند‏، ارجحيت دارد و می توان:

الف- هر نمونه بصورت دوبل آزمايش شود و به يكي از نمونه‌ها تعداد اندكي باسيل M. bovis BCG اضافه شود (spiked sample). اما تمايل مايكوباكتريوم‌ها به تشكيل كلامپ تهيه سوسپانسيون مناسب را مشكل مي‌كند، به همين دليل ريجنت‌هاي كنترل بايد تحت شرايط استاندارد تهيه شوند و بصورت تجارتي در دسترس قرار گيرند.

ب- استفاده از تارگت مديفيه شده: Kolk و همكاران درگزارشي جالب، از يك سوية تغيير يافته M. smegmatis استفاده كردند. در اين سويه، ماركر ژنتيكي IS6110 اندكي از IS6110 تيپ وحشي بزرگتر بود. با اضافه كردن تعداد اندكي از چنين سويه‌اي به هر نمونه باليني، يك كنترل داخلي تقريباً كامل بدست مي‌آيد.

•3- استفاده از دو سيستم تكثير با پرايمرهاي اختصاصي برای سكانس‌های هدف متفاوت در ژنوم M. tuberculosis نتايج قابل اعتمادتري دارد.

•4- آزمايش مجدد نمونه‌هايي كه مثبت شده‌اند، موارد مثبت كاذب را كمتر مي‌كند.

تشخيص بالينی و روش‌های NAA :

اكثر مطالعات نتايج روش‌هاي NAA را بر مبناي ملاك‌هاي آزمايشگاهي ارزيابي كرده‌اند، اما تعاريف باليني و آزمايشگاهي از بيماري ممكن است تفاوت داشته باشند. تشخيص آزمايشگاهي در سطح آناليز نمونه انجام مي‌شود، اما تشخيص باليني بر موارد متعددي همانند علائم و نشانه باليني، نتايج آزمايشگاهي و پاسخ به درمان استوار است.

در موارد تشخيصي پيچيده‌اي همچون توبركولوز، تعيين clinical risk مي‌تواند در مورد ارزش پيش‌بيني (predictive value) يك تست اطلاعات مهمي بدست دهد، به عبارت ديگر «شك باليني به (CSTB) TB» كه متكي بر قضاوت پزشك است و به سه سطح: شك كم، متوسط و زياد تقسيم مي‌شود مي‌تواند راهنماي استفاده از تست‌هاي NAA درگروه بيماران با سطوح متفاوت CSTB باشد.

ارزش پيش‌بيني مثبت (PPV) يك تست، پيش‌بيني درستي نتيجه مثبت تست درفرد بيمار مي‌باشد. بالا بودن حساسيت و ويژگي لزوماً بيانگر بالا بودن PPV نمي‌باشند، زيرا ميزان شيوع و پراكندگي بيماري فاكتور مهمي در تعيين ميزان صحت PPV مي‌باشد. روابط فوق‌الذكر در فرمول زير نمايش داده شده است.

درصد پيش‌بيني مثبت :

به عنوان مثال اگر حساسيت و ويژگي آزمايش هر يك %95 باشد، در دو پراكندگي متفاوت 50% و 5% بيماري، ميزان پيش‌بيني مثبت بترتيب 95% و 50% خواهد بود يعني در حالت اخير فقط در 50% موارد نتيجه مثبت آزمايش واقعا" مثبت مي‌باشد.

هر چند تست‌های NAA براي تشخيص اوليه در بيماران مشكوك به توبركولوز توصيه مي‌شود، اما درحال حاضر اين تستها نبايد بطور روتين براي بيماران «low CSTB» درخواست شوند زيرا PPV در چنين مواردي نزديك به 50% است. دربيماران فوق‌الذكر تست‌هاي AFB Smear و NAA براي كنار گذاشتن بيماري مناسب، اما براي اثبات آن متقاعدكننده نيستند، زيرا در اين گروه بيماران نتايج مثبت كاذب ممكن است نزديك به موارد مثبت واقعي برسند، تست‌هاي مذكور براي اثبات بيماري درگروه «high CSTB» مفيد مي‌باشند.

در بيماراني كه اسمير خلط آنها منفي است، PPV مربوط به تستهاي NAA، حتي با استفاده از كيت‌هاي مورد تأييد FDA، پايين مي‌باشد و توصيه مي‌شود در اين گروه از بيماران تست‌هاي NAA زماني درخواست شود كه تظاهرات باليني قوياً به نفع TB باشد.

توجه به نكات ذيل درانتخاب تست‌ها و تصميم‌گيري مناسب، مفيد مي‌باشد:

•1- درتشخيص آزمايشگاهي توبركولوز هيچ تستي به تنهايي كامل نيست.

•2- تست‌هاي NAA نقش مكمل دارند، اما جانشين AFB Smear  كشت و قضاوت باليني نيستند و براي هر نمونه‌اي روش‌هاي روتين (كشت و اسمير) نيز بايد بطور موازي انجام شود.

•3- حساسيت روش‌هاي NAA از كشت كمتر و از AFB Smear بالاتر است.

•4- كشت همچنان براي تأييد آزمايشگاهي توبركولوز استاندارد طلايي مي‌باشد.

•5- انجام آزماش باكتريولوژيك نبايد تا زمان حصول نتايج تست NAA به تأخير بيفتد.

•6- تست‌هاي NAA كه درحال حاضر دردسترس مي‌باشند نبايد بطور روتين براي بيماران «low CSTB» درخواست شوند.

•7- نتيجة منفي NAA نبايد به عنوان ملاك قطعي رد توبركولوز تلقي شود، بخصوص در بيماراني كه CSTB متوسط و بالا باشد، اما مي‌تواند به عنوان اطلاعات زمينه‌اي براي تصميم‌گيري باليني، تشخيص افتراقي و يا جلوگيري از درمان غيرضروري منظور گردد.

الگوريتم آزمايش و تفسير تست‌هاي NAA :

CDC الگوريتم تشخيصی ذيل را توصيه نموده است:

•1-  نمونه‌هاي تنفسي بطور روتين براي انجام تست‌هاي اسمير و كشت جمع‌آوري شوند. حداقل بر روي يك نمونه آزمايش NAA انجام شود.

•2-  نتايج تست‌هاي NAA درارتباط با نتايج AFB Smear تفسير شوند.

الف- قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد، درانتظار نتيجة كشت و تست‌هاي تشخيصي باشيد.

ب- حضور مهاركننده درنمونه بررسي شود و نمونه ديگري با روش NAA تست شود.

  • مهاركننده حضور دارد: براي اين نمونه روش NAA كمك‌ كننده نيست، قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. درانتظار نتيجة ‌كشت و تست‌هاي تشخيصي ديگر باشيد.
  • مهاركننده حضور ندارد: قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. درانتظار نتيجه كشت باشيد اگر نمونه دوم نيز مجدداً همين شرايط را داشته باشد وجود مايكوباكتريوم غيرتوبركولوزي (MOTT) محتمل است.

ج- قضاوت باليني ملاك شروع درمان باشد. در انتظار نتيجه كشت باشيد. براي تاييد نتيجه NAA، نمونه ديگری آزمايش شود. اگر نتيجه NAA دو يا چند نمونه مثبت بود تا زمان مشخص شدن نتيجه كشت، وجود توبركولوز محتمل است.

د- وجود توبركولوز محتمل است، درمان شروع شود. منتظر جواب كشت نيز باشيد.

References :

1- American Thoracic Society. 2000. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med, 161:1376-1395

2- Boer, A.S., B. Blommerde., P.W.Hass, et al. False-positive Mycobacterium tuberculosis cultures in 44 laboratories in the Netherlands (1993 to 2000): Incidence, Risk factors, and consequences. J. Clin Microbiol. 2002, 40:4004-4009.

3- Cohen, R. A., S. Muzaffar., D. Schwartz, et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis using PCR assay on sputum collected within 24 hours of hospital admission.

  Am J Respir Crit Care Med. 1998, 157:156-161.

4- CDC. Update: nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR 2000; 49:593-594.

5- CDC. Updated Guidelines for the juse of Nucleic Acid Amplification Tests in the Diagnosis of Tuberculosis. MMWR 2009, 58(01): 7-10

6- Cartanzaro, A., S. Perry., J. E. Clarridge, et al. The role of clinical suspicion in Evaluating a new diagnostic test for active tuberculosis. JAMA, 2000, 283: 639-645.

7- Henry's Clinical Diagnosis and Management by laboratory methods, Twenty-first ed, 2007.

8- Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology Sixth ed. 2006.

9- Kaul, K., S. Luke, C. McGurn, et al. Amplification of residual DNA sequences in steril bronchoscopes leading to fals-positive PCR results. J Clin Microbiol. 1996, 34:1949-1951.

10- Kaul, K. L. Molecular detection of Mycobacterium tuberculosis: Impact on patient care.

   Clinical chemistry, 2001, 47: 1553-1558

11- Long, R. Smear-negative pulmonary Tuberculosis in industrialized countries.

   CHEST. 2001, 120 (2): 330-334

12- Mandel GL, Bennett JE and Dolin R. Principles and practice of infections Disease, 7th ed 2010.

13- Noordhoek, G. T., J. D. Embden., A. H. J. Kolk. Reliability of Nucleic Acid Amplification for detection of Mycobacterium tuberculosis: an International Collaborative Quality Control Study among 30 Laboratories. J Clin Microbiol. 1996, 34:2522-2525.

14- Noordhoek, G. T., A. H. J. Kolk., G. Bjune, et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: a Blind Comparison study among Seven Laboratories. J Clin Microbiol. 1994, 32:277-284.

15- Perry, S., A. Catanzaro. Use of clinical risk assessments in evaluation of nucleic acid amplification tests for HIV/tuberculosis. INT J TUBERC LUNG DIS. 2000, 4(2):534-540.

16- Ramsey, A. H., T. V. Oemig., J. P. Davis., et al. An outbreak of Bronchoscopy-related Mycobacterium tuberculosis infections due to lack of Bronchoscope leak testing. Chest 2002; 121:976-981.

17- Ridderhof, J. C., L. O. Williams., S. Legois, et al. Assesment of laboratory performance of nucleic acid amplification test for detection of Mycobacterium tuborculosis. J Clin Microbiol 2003, 41:5258-5261.

18- Ruddy. M., T. D. McHugh., W. Dale, et al. Estimation of the rate of unrecognized Cross-Contamination with Mycobacterium Tuberculosis in London Microbiology Laboratories. J Clin Microbiol, 2002, 40:4100-4104.

19- Small, P. M., N. B, McClenny., S. P. Singh, et al. Molecular strain typing of Mycobacteriology laboratory and modification of procedures to minimize occurrence of fals-positive cultures. J Clin Microbiol 1993, 31:1677-1682.

20- WHO. Use of liquid TB culture and Drug Susceptibility Testing (DST) in low and medium income setting. 2007, www.WHO.INT.

21- دكتر اكبر ملك‌پور‏، دكتر شكوه يوسفي، مديريت كنترل كيفيت متعادل براي آزمايشگاه‌هاي تشخيص پزشكي، چاپ اول سال 1386، ناشر انجمن علمي دكتراي علوم آزمايشگاهي.

[*] - اهمیت این یافته‌ها در منابع علمی جدید کماکان مطرح است.(منابع شماره 7و12)