روش آزمايشگاهی تجزيه مايع نخاع

نوشته شده توسط مدیر سایت on . Posted in بیوشیمی خون

 دكتر سعيد مهدوي - دكتراي علوم آزمايشگاهي                                         

CSF 00

مايع مغزي- نخاعي اولين بار در سال 1764 توسط فردي به‌ نام Cotango شناخته شد، اين مايع از شبكه كروئيد داخل مغز توليد و موجب تامين مواد غذايي و دفع مواد زائد و سدي مكانيكي جهت بافت عصبي مغز مي‌باشد.

مقدار تام اين مايع كه دائما در حال توليد مي‌باشد، در نوزادان و بالغين متفاوت و به ترتيب حدود 60-10 ميلي‌ليتر و 170-140 ميلي‌ليتر و حدودا" در هر ساعت 20 ميلي‌ليتر از اين مايع توليد مي‌گردد.

جهت بررسي اين مايع، پزشكان باليني از بين مهره‌هاي سوم و چهارم يا پنجم كمري و با سوزني خاص مايع را آسپيره مي‌نمايند. نمونه در سه ظرف تميز و استريل در پيچ دار جهت تجزيه در بخش‌هاي بيوشيمي و سرولوژي، ميكروبشناسي، شمارش سلولي ارسال مي‌شود.

انجام آزمايشات بر روي اين مايع ذاتا" اورژانس است، چه بر روي برگه آزمايش نوشته شده باشد يا خير و بايد هرچه سريعتر در آزمايشگاه مورد بررسي قرار گيرد، اما اگر به هر دليل شرايط تجزيه مايع فراهم نبود:

  •  لوله اول (بيوشيمي) بهتر است تا 6 ساعت در يخچال 4 درجه سانتيگراد نگهداري شود و نگهداري طولاني‌تر در 20- درجه سانتيگراد ذخيره شود.   
  •  لوله دوم (ميكروبشناسي) بهتر است در حرارت اتاق (20 تا 25 درجه سانتيگراد) نگهداري شود.
  •  لوله سوم (شمارش سلول) بهتر است در حرارت 4 درجه سانتيگراد و در يخچال معمولي نگهداري شود.

در زمان اخذ نمونه بايد برچسب نمونه‌ها كامل و حاوي اطلاعات زير باشد:

نام، نام خانوادگي، سن و جنس، نام پزشك، نام بخش، شماره اطاق و تخت، تاريخ، ساعت اخذ، نام پزشك معالج، محل آناتوميك جمع‌آوري نمونه (نخاع كمري، شنت و..) تشخيص باليني، درمان آنتي‌بيوتيكي.

  •  لوله‌ها بايد بلافاصله و بدون فوت وقت توسط پرسنل بخش، انترن يا رزيدنت و در رك‌‌هاي از قبل آماده شده به آزمايشگاه منتقل شود.
  •  از پنبه يا هر درپوش ديگري جهت بستن درب لوله‌ها پرهيز گردد.
  •  به محض رسيدن به آزمايشگاه ساعت ورود و تاريخ در دفتر مخصوص مايع مغزي نخاعي ثبت گردد و مشخصات آن در دفتر قيد شود.

تجزيه CSF در بخش شمارش سلول:

به طور كلي در اين بخش چهار عمل بر روي آن انجام مي‌شود.

•1-    گزارش ظاهر يا Appearance مايع مغزي نخاعي بر اساس جدول ذيل

•2-   شمارش سلول آن بر اساس روشي كه ذيلا قيد مي‌شود.

•3-  تصحيح احتمالي شمارش سلولي در صورت ورود خون به CSF

•4-   شمارش افتراقي سلول‌ها (Diff)

APPEARANCE                           CAUSE                MAJOR SIGNIFICANCE

Crystal clear                                                    Normal

Hazy,turbid,cloudy,                     WBCs                            Meningitis

Smoky, milky                     RBCs                             Hemorrhage

                                                                        Traumatic tap

                                           Microorganisms   Meningitis

                                           Protein                           Disorders that affect blood-brain barrier

                                                                        Production of 1gG within CNS

Oily                                    Radiographic                

                                           Contrast

                                           Material

Bloody                                RBCs                             Hemorrhage

Xanthochromic                            Hemoglobin                   Old hemorrhage

                                                                        Lysed cells from traumatic tap

                                           Bilirubin               RBC breakdown

                                                                        Elevated serum bilirubin

                                           Merthiolate           Contamination

                                           Carotene               Increased serum levels

                                           Protein                           SEE ABOVE

Clotted                                Protein                           SEE ABOVE

                                           Clotting factors              Introduced by traumatic tap

Pellicle formation                         Protein                           Tubercular meningitis

                                           Clotting factors

-    اگر يك نمونه داراي ظاهري Bloody باشد، اين خون يا داراي منشاء داخلي و خونريزي مغزي است و يا ناشي از بزل تروماتيك مي‌باشد. اگر خون داخل مايع مغزي- نخاعي ناشي از خونريزي باشد:

الف) در هر سه لوله ارسال شده به صورت يكنواخت ديده مي‌شود.

ب) مايع بدون تشكيل لخته در آن مي‌باشد.

ج) مايع CSF از ابتدا و بلافاصله بعد از اخذ داراي رنگ زرد فام مي‌باشد.

        -    اگر خون داخل مايع CSF ناشي از بزل تروماتيك باشد:

الف) در لوله اول بيشتر است و كم كم مايع در لوله‌هاي ديگر صاف مي‌شود.

ب) ممكن است بدليل وجود فيبرينوژن در آن لخته وجود داشته باشد.

ج) چون خون موجود در مايع كم‌كم هموليز مي‌شود، بعد از 2 ساعت مايع روي CSF زرد فام مي‌گردد.

      -   گاهي اوقات بدليل آسيب به سد خوني مغزي (B.B.B) بدليل مننژيت يا سندروم Froms، فاكتورهاي انعقادي پالايش شده (فيلتر) بدون ايجاد ظاهرخوني مايع مغزي نخاعي لخته مي‌شود.

    -  قبلا وجود ‌‌‌‌R.B.C هاي كنگره‌اي را دليلي بر خونريزي داخل جمجمه‌اي مي‌دانستند، ولي هم‌اكنون آنرا دليل قابل اعتمادي نمي‌دانند.

   -  جهت شمارش گلبولهاي سفيد به‌خصوص گرانولوسيت‌ها، بايد سريعا" اقدام نمود، چون يك ساعت بعد از نمونه‌گيري شروع به هموليز مي‌كند و از مقدار آنها كاسته مي‌شود، به طوري كه بعد از دو ساعت 40% از لكوسيت‌ها از بين مي‌روند.

اهميت شمارش سلولها در مايع مغزي-نخاعي در درجه اول مربوط به همين گلبولهاي سفيد است، چون وجود يا عدم وجود RBC تا حدودي از  ظاهر آن معلوم است و جهت تصحيح تعداد گلبول‌هاي سفيد، آنها هم شمارش مي‌شوند.

مقدار طبيعي گلبولهاي سفيد در بالغين، بين 0 تا 5 سلول در هر ميكروليتر است و در نوزادان بين 0 تا 30 سلول در هر ميكروليتر. در قديم معتقد بودند كه همه سلول‌هاي موجود بايد تك هسته‌اي باشند، ولي با مشاهده ميكروسكوپ الكتروني متوجه شدند بعضي از اين سلولها مي‌تواند PMN باشد. از آنجا كه وجود گلبول‌هاي سفيد تا 200 عدد و گلبول‌هاي قرمز تا 400 عدد در هر ميكرومتر تغييري در ظاهر CSF ايجاد نمي‌كند، لازم است كليه نمونه‌ها زير ميكروسكوپ مطالعه و بررسي شوند. چون تعداد اين سلول‌ها بسيار پايين است. در شمارش آنها هرگز از سل‌كانتر استفاده نشود، بلكه لازم است از لام نئوبار اصلاح شده (improved neubaure) استفاده و طبق فرمول زير محاسبه شود.

                              فاكتور رقت  ×   تعداد سلول شمارش شده

                        ---------------------------------------------------- =  تعداد سلول در ميكروليتر

                           حجم يك مربع  ×   تعداد مربع‌هاي شمارش شده

-  در ديد اوليه اگر ظاهر نمونه كدر بود، بر اساس جدول زير مي‌توان رقت تهيه نمود و از تكرار پرهيز كرد.

   ظاهر                                   رقت                          مقدار نمونه              مقدار مايع رقيق كننده

كمي مه اي (Sl.Hazy)                  10 :  1                      30 ميكروليتر              270 ميكروليتر

   مه اي (Hazy)                         20 :  1                      30 ميكروليتر              570 ميكروليتر

كمي ابري(Sl. Cloudy)                100: 1                    30 ميكروليتر              970 ميكروليتر

    كمي خوني (Sl. bloody)               200‌: 1                    30 ميكروليتر              5970 ميكروليتر

خوني (bloody)        10,000: 1        0/1 ميلي ليتر  و  از نمونه بارقت 100 : 1       9/9 ميلي ليتر

اگر پس از مشاهده زير ميكروسكوپ متوجه تعداد زياد R.B.C شديم، بايد آنها را به روشي كه موجب افزايش رقت نشود به‌ روش زير آنها را ليز نمائيم.

الف) ابتدا لوله را خوب مخلوط مي‌كنيم و چهار قطره ‌CSF را در يك لوله ديگر مي‌ريزيم.

ب) يك پيپت پاستور را با چند بار كشيدن و خالي كردن به اسيداستيك گلاسيال آغشته مي‌كنيم.

ج) چهار قطره  CSF را داخل لوله موئينه پيپت پاستور كشيده، يك دقيقه صبر مي‌كنيم.

د) سپس آنها را در لوله مجددا" مخلوط كرده، قطره اول را دور مي‌ريزيم، مابقي را زير هموسيتومتر شمارش نموده و تعداد نهايي را با استفاده از فرمول داده شده محاسبه مي‌نمائيم.

- اگر چنانچه نمونه CSF حاوي تعداد زيادي RBC بود، پس از شمارش تعداد گلبول‌هاي قرمز لازم است يك CBC از بيمار چك شود و مقدار گلبولهاي سفيد CSF به روش زير تصحيح شود.

              گلبول سفيد اضافه شده  -  گلبول سفيد اوليه CSF  = گلبول سفيد واقعي CSF

                                                 گلبول‌هاي قرمزCSF

                  گلبولهاي سفيد خون × ----------------------------   = گلبول سفيد اضافه شده CSF

                                                  گلبولهاي قرمز خون

در يك روش سريع اگر مقدار گلبول‌هاي سفيد و قرمز خون محيطي طبيعي بود، مي‌توان بازاء هر 750 عدد گلبول قرمز موجود در CSF  يك سلول ار لكوسيت CSF كم كرد. در صورت نياز به شمارش افتراقي و زيادتر بودن تعداد لكوسيت‌ها از مقدار طبيعي، حتما" بايد يك گسترش روي لام تهيه و رنگ‌آميزي نمود و از شمارش افتراقي روي لام هموسيتومتر پرهيز كرد.

كلا" جهت تغليظ سلول‌ها در CSF از سه روش استفاده مي‌شود: 1) فيلتراسيون 2) رسوب دادن با سانتريفوژ معمولي 3)سيتوسانتريفوژ در صورت استفاده از سانتريفوژ معمولي. بعد از 10-5 دقيقه سانتريفوژ در 2000 RPM مايع رويي را جهت انجام آزمايشات احتمالي ديگر نگهداري و سديمان را درcc  0/5 مايع باقي‌مانده مخلوط مي‌كنيم و يك گسترش روي لام تهيه و با رنگ رايت رنگ‌آميزي و مطالعه مي كنيم.

جهت شمارش افتراقي بهتراست از سيتوسانتريفوژ استفاده شود: چون هم احتمال يافتن مقدار سلول‌ها را بالا مي‌برد و هم بدليل داشتن آلبومين موجب حذف اشكال غير طبيعي مانند واكوئل و زوائد سيتوپلاسمي و شكاف هسته و هستك واضح و تجمع سلولي مي‌گردد. لازم است همان دقتي را كه در مورد ديف (Diff) گسترش خون محيطي انجام داديم، اينجا هم داشته باشيم. چون ممكن است انواع سلول‌ها خوش‌خيم (اپانديم - كوروئيد) يا بدخيم در CSF ديده شود. ضمنا" تشخيص سلول‌هاي تك‌هسته‌اي ماكروفاژ يا ماكروفاژهايي كه گلبولهاي قرمز را بلعيده باشند (بيانگر خونريزي قبلي) مهم به نظر مي‌رسد. ضمنا" ممكن است سلول‌هاي موجود در CSF منشاء ديگري داشته باشند، يعني فرد مبتلا به ارسمي يا لنفوم باشد و سلول‌هاي بدخيم وارد CSF شده باشند كه تشخيص آنها اهميت زيادي دارد. لذا بايد به سلول‌هاي چسبيده به‌ همديگر نامنظمي هسته، هستك‌هاي پررنگ توجه بيشتري داشت.

وجود سلول‌هاي متنوع در مايع مغزي- نخاعي از جمله نوتروفيل، لنفوسيت و منوسيت را پلئوسيتوز مي‌گويند. در بالغين معمولا" نسبت سلول‌هاي تك‌هسته‌اي لنفوسيت به منوسيت 70 به 30 است، در حاليكه در بچه‌ها منوسيت بيشتر است. به‌طور كلي اگر سلول‌هاي گلبولهاي سفيد زياد بود و PMN  غالب بود، فرد مشكوك به مننژيت باكتريايي است و اگر سلول‌هاي گلبول سفيد زياد بود و سلول‌هاي MN غالب بود، فرد مشكوك به مننژيت ويروسي يا قارچي يا سلي يا انگلي است.

اگر سلولهاي كم (كمتر از 25 سلول در ميكروليتر) ولي MN  غالب باشد، ممكن است مولتيپل اسكلروزيس باشد و اگر بعد از رنگ رايت در گسترش تهيه شده NRBC ديده شد، احتمال آلودگي نمونه با مغز استخوان وجود دارد.