آنالیز اسپرم- 1

on . Posted in ناباروری

مقدمه

human sperm and egg artwork

مایع منی كه طی انزال خارج می شود، متشكل است از سوسپانسیون غلیظ اسپرماتوزوئیدهای ذخیره شده در اپیدیدیم ومایعی كه توسط ارگانهای ضمیمه‌ای جنسی ساخته شده و با اضافه شدن به این سوسپانسیون، باعث رقیق شدن آن می گردد. مقایسه حجم مایع منی قبل و بعد از وازكتومی نشان می دهد كه حدود 90 درصد از آن‌ را ترشحاتی تشكیل می دهند كه توسط ارگانهای ضمیمه ای تولید می گردند. این ترشحات عمدتا" توسط پروستات و وزیكولهای سمینال ساخته می شوند و غدد پیازی- میزراهی (كوپر) واپیدیدیمها بخش اندكی از آن را تولید می‌كنند.

دو ویژگی قابل سنجش مهم مایع منی عبارتند از:

- تعداد كل اسپرمها: نشا نگر آن است كه تولید اسپرم توسط بیضه‌ها وانتقال آنها در مجاری مربوطه كه پس از بیضه ها قرار دارند صحیح صورت می گیرد.

- حجم كل مایع منی: نشانگر فعالیت ترشحی غدد ضمیمه‌ای جنسی است.

ماهیت اسپرم ( زنده بودن، تحرك و مورفولوژی ) و تركیب مایع منی نیز در میزان فعالیت اسپرم نقش دارند.

در هنگام مقاربت، بخش ابتدایی مایع منی (بخش پروستاتی آن) كه غنی ازاسپرم می‌باشد با موكوس سرویكال كه تا واژن كشیده شده تماس پیدا می كند، درحالیكه بقیه مایع منی در واژن باقی می ماند. در ارزیابی‌های آزمایشگاهی برعكس حالت فوق، كل مایع منی در یك ظرف جمع‌آوری می گردد و در آن اسپرمها در یك توده منعقد به دام می‌افتند. این توده منعقد ناشی از وجود پروتئینهایی است كه وزیكولهای سمینال می سازند و به تدریج در اثر فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیك حل شده واسمولالیته آن افزایش می یابد.

شواهد موجود نشان می دهد كه روش نمونه‌گیری بر كیفیت نمونه‌های بدست آمده تاثیر دارد. نمونه‌هایی كه در آزمایشگاه به‌ روش استمناء در داخل ظروف مخصوص گرفته می شوند، در مقایسه با نمونه‌هایی كه در منزل به‌ روش نزدیكی و در داخل كاندوم‌های فاقد مواد اسپرم كش گرفته می شوند از كیفیت كمتری برخوردارند. این اختلاف می تواند ناشی از تفاوت در تحریك جنسی باشد. زمانی كه برای گرفتن نمونه به روش استمناء صرف می شود نیز بر كیفیت آن موثراست.

وقتی نمونه در شرایط معینی گرفته شود كیفیت آن تحت تاثیر فاكتورهای غیرقابل تغییری قرار می گیرد مثلا" میزان اسپرم‌سازی بیضه‌ها ، میزان فعالیت غدد ترشحی و وجود بیماریهایی كه اخیرا" در فرد وجود داشته‌اند مثل تب. همچنین مدت زمانی كه از آخرین انزال فرد گذشته می‌بایستی گزارش شده، در تفسیر نتایج مد نظر قرارگیرد.        

آنالیز اسپرم شامل مراحل زیر است كه بعدا" به تفصیل به آنها خواهیم پرداخت:

- در5 دقیقه اول نمونه را در انكوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا سیال شدن نمونه را ارزیابی كنیم.

- بین 30 تا 60 دقیقه موارد زیر را بررسی می كنیم:

· بررسی ظاهر و سیال شدن مایع منی

· اندازه گیری حجم مایع منی

· اندازه گیری PH (درصورت نیاز)

· تهیه لام مستقیم از نمونه جهت بررسی ظاهر میكروسكپی، میزان تحرك وتعیین رقت لازم برای شمارش اسپرم

· بررسی میزان زنده بودن اسپرمها (درصورتی كه درصد اسپرم های متحرك كم باشد)

· تهیه اسمیر ازمایع منی برای ارزیابی مورفولوژی اسپرم

· تهیه رقت ازمایع منی برای ارزیابی غلظت اسپرم

· شمارش اسپرم

· Mixed agglutination test=Mar)) انجام واكنش اگلوتیناسیون مخلوط درصورت نیاز

· ارزیابی سلولهای پراكسیداز مثبت درصورت وجود سلولهای گرد Round cells

· آماده سازی اسپرم ها برای تست ایمونوبید درصورت نیاز

· سانتریفوژ كردن نمونه در صورتی كه انجام آزمایشات بیوشیمی مد نظرباشد.

- در طی سه ساعت: ارسال نمونه به آزمایشگاه میكروب شناسی درصورت نیاز

- پس از 4 ساعت تا آخرهمان روز( یا روز بعد درصورتی كه نمونه فریز شود):

· ارزیابی ماركرهای غدد ضمیمه‌ای درصورت نیاز

· انجام آزمایش ایمونوبید غیرمستقیم درصورت نیاز

1 . جمع آوری نمونه برای بررسی های تشخیصی یا تحقیقاتی

- دستورالعملهای كتبی وشفاهی درباره روش گرفتن نمونه می بایستی به بیمار داده شود. به بیمار بایستی تاكید كرد كه كل نمونه را جمع‌آوری كرده و در صورتی كه موفق به این كار نشده، این مطلب را به آزمایشگاه گزارش نماید.

- برای پیشگیری ازتاثیرات دما بر روی نمونه و كنترل زمان بین نمونه گیری و انجام آزمایش، بهتر است نمونه در یك اتاق خصوصی در نزدیكی آزمایشگاه گرفته شود.

- نمونه باید حداقل 2 وحداكثر7 روز پس از آخرین تماس جنسی گرفته شود. درصورتی كه نیاز به گرفتن نمونه مجدد باشد، زمان فوق بایستی برای نمونه‌های بعدی نیز یكسان باشد.

- نام بیمار، تاریخ تولد، كد بیمار، مدت پرهیز از تماس جنسی abstinence ، روز و ساعت گرفتن نمونه برروی ظرف جمع آوری درج شود.

- نمونه بایستی به روش خود تحریكی masturbation گرفته شود و در یك ظرف شیشه‌ای یا پلاستیكی تمیز كه غیرسمی بودن آن برای اسپرمها اثبات شده باشد، جمع‌آوری گردد. (به توضیحات داخل کادر زیر مراجعه نمایید)* ظرفی كه قرار است نمونه در آن گرفته شود، باید قبلا در حرارت بین 20 تا 37 درجه قرار داده شود تا از اثر تغییرات ناگهانی دما بر روی اسپرم جلوگیری شود.

در طول مدت سیال شدن، نمونه را روی میز یا انكوباتور 37 درجه قرار می دهیم.

درصورتی كه نمونه كامل جمع آوری نشده باشد بخصوص اگر بخش اول آن كه غنی از اسپرم است گرفته نشده باشد، باید حتما در گزارش بیمار ذكر شود.

IMG 20180612 WA0001

 

*روش تایید مناسب بودن ظروف نمونه گیری اسپرم

چند نمونه مایع منی كه دارای تعداد زیادی اسپرم با تحرك خوب هستند را انتخاب نمایید. نیمی از هر نمونه را در ظروف غیرسمی (كنترل) و نیم دیگر را در ظروفی كه كیفیت آنها مشخص نیست، قرار می دهیم. در دمای اتاق یا 37 درجه میزان تحرك اسپرمها را در فواصل یك ساعته به مدت 4 ساعت بررسی می كنیم. اگراختلاف معناداری بین ظروف تحرك اسپرم ها در این دو ظرف دیده نشود، می توان ظروف مورد نظر راغیر سمی و مناسب نمونه اعلام کرد.

جمع آوری مایع منی برای لقاح مصنوعی

روش جمع آوری نمونه مشابه روشی است كه در بالا ذكر شد با این تفاوت كه ظروف، سر سمپلرها و پیپت‌های مورد استفاده باید استریل باشند.

جمع‌آوری استریل مایع منی برای آزمایشات میكروبی

برای این كار بایستی از آلودگی نمونه با میكروبهایی كه منشا آنها مایع منی نیست، جلوگیری كرد ( مثل میكروارگانیسمهای كمنسال پوست). ظروف نمونه گیری، سرسمپلرها و پیپت‌های مورد استفاده باید استریل باشند.

بیمار بایستی :

* ابتدا ادرار نماید.

* سپس برای جلوگیری ازآلودگی پوست با میكروارگانیسمهای كمنسال، دستها و آلت را با آب و صابون بشوید.

* با آب موضع را آبكشی نماید.

* دستها و آلت را با یك دستمال یكبارمصرف خشك نماید.

* نمونه را داخل ظرف یكبار مصرف بگیرد.

توجه : فاصله بین زمان گرفتن نمونه و انجام آزمایشات میكروبی نباید از 3 ساعت تجاوز نماید.

جمع آوری نمونه درمنزل

در شرایط استثنایی ممكن است نمونه در منزل گرفته شود، مثلا" زمانیكه فرد نمی تواند در آزمایشگاه نمونه دهد و یا امكانات لازم برای گرفتن نمونه در نزدیكی آزمایشگاه وجود ندارد. دستورالعملهای لازم در خصوص گرفتن و ارسال نمونه باید بطور شفاهی و كتبی در اختیار بیمار قرار گیرد. به بیمار باید تاكید شود كه كل نمونه مایع منی ( بخصوص بخش اول آن كه غنی از اسپرم است ) را داخل ظرف جمع‌آوری نماید و اگر نمونه را كاملا جمع آوری نكرده، حتما" آن را گزارش نماید تا در جواب بیمار ذكر شود.

به بیمار ظرفی داده می شود كه روی آن نام و كد بیمار ثبت شده است. زمان گرفتن نمونه توسط بیمار یادداشت شده و نمونه طی یك ساعت به آزمایشگاه تحویل داده می شود. در زمان حمل نمونه دمای آن باید بین 20 تا 37 درجه حفظ شود.

درگزارش نتایج بیمار باید قید شود كه نمونه در منزل یا جایی خارج از آزمایشگاه گرفته شده است.

جمع آوری نمونه توسط كاندوم

در موارد استثنایی كه فرد قادر نیست به‌ روش خود تحریکی نمونه‌ گیری نماید، می تواند با استفاده ازكاندوم در هنگام مقاربت نمونه را جمع‌آوری كند. برای اینكار فقط از كاندوم هایی استفاده می شود كه فاقد مواد كشنده اسپرم هستند. این كاندومها بصورت تجارتی در دسترس می‌باشند. بیمار باید اطلاعات كارخانه سازنده را مطالعه كند و پس از گرفتن نمونه آنرا بسته، زمان نمونه گیری را یادداشت نموده و طی یك ساعت به آزمایشگاه ارسال نماید. در زمان حمل نمونه دمای آن باید بین 20 تا 37 درجه حفظ شود. درگزارش نتایج بیمار باید قید شود كه نمونه با كاندوم مخصوص طی عمل مقاربت و در خارج از آزمایشگاه گرفته شده است.

توجه: از كاندومهای معمولی نباید برای جمع‌آوری اسپرم استفاده نمود، زیرا حاوی موادی هستند كه بر حركت اسپرمها تاثیر منفی می گذارند.

نكته 1-  جمع آوری مایع منی بدون كاندوم و با مقاربت توصیه نمی شود، زیرا قسمت اول مایع منی كه حاوی بیشترین تعداد اسپرم می باشد ممكن است ازدست برود. بعلاوه آلودگی با سلولها و باكتریهای واژن ممكن است رخ دهد و PH اسیدی ترشحات واژن می تواند اثرات سوء بر تحرك اسپرم  داشته باشد.        

 نكته 2- اگر فردی نتواند نمونه اسپرم جمع‌آوری نماید با بررسی موكوس سرویكال پس از نزدیكی می توان اطلاعاتی را در مورد شرایط اسپرمهای وی بدست آورد.                  

ایمنی در مراحل كار با نمونه

نمونه مایع منی ممكن است حاوی عوامل عفونی خطرناك (مثل ویروس ایدز، هپاتیت و هرپس سیمپلكس) باشد و لذا باید به عنوان یك نمونه بیولوژیك خطرناك با آن رفتار شود.

 در صورتی كه قرار است مطالعات زیست سنجی، تزریقIVF، باروری آزمایشگاهی IUI و تلقیح سیتوپلاسمی اسپرم انجام شود، از مواد و روشهای استریل استفاده کرده و از دستورالعملهای ایمنی و روشهای صحیح كار که اساس ایمنی در آزمایشگاه هستند باید اكیداً پیروی نمود.

2 . آزمایشات ماكروسكپی اولیه

آنالیز اسپرم را باید بلافاصله پس از سیال شدن نمونه آغاز نمود. زمان شروع آنالیز معمولا" 30 دقیقه پس از انزال است و نباید از یك ساعت بیشتر شود، زیرا دهیدراتاسیون یا تغییرات دما بر كیفیت مایع منی اثر می گذارد.

Liquefaction ( سیال شدن )

بلافاصله پس از انزال، مایع منی بصورت یك توده نیمه منعقد است. پس از چند دقیقه در حرارت اتاق شروع به سیال شدن می كند و طی آن یك مخلوط ناهمگن ایجاد می شود كه به صورت توده‌هایی در یك مایع است. هرچه سیالیت بیشتر شود، مایع منی همگن‌تر و آبكی‌تر می شود و در آخر مقدار اندكی بصورت توده منعقد باقی می ماند. سیال شدن نمونه در حرارت اتاق معمولا" طی 15 دقیقه رخ می دهد، اگرچه بندرت تا 60 دقیقه یا بیشتر نیز طول می كشد. اگرسیال شدن كامل طی 60 دقیقه رخ نداد، باید آن را گزارش نمود. نمونه‌هایی كه در منزل یا بوسیله كاندوم گرفته می شوند معمولا هنگام رسیدن به آزمایشگاه سیال شده‌اند. نمونه‌های منی طبیعی كه سیال شده‌اند ممكن است حاوی دانه های ژل مانندی (اجسام ژلاتینی) باشند كه سیال نمی‌شوند. به نظر می‌رسد این ذرات هیچگونه اهمیت بالینی ندارند. وجود رگه های موكوس ممكن است در آنالیز منی ایجاد تداخل نماید.

"توجه"

1- سیال شدن هم بصورت ماكروسكپی(در بالا توضیح داده شد) و هم بصورت میكروسكپی قابل ارزیابی است. هرچه نمونه سیال‌تر می شود، اسپرمهای ساكن توانایی حركت بیشتری پیدا می‌كنند. اگر در مشاهده میكروسكپی اسپرمهای بی حركت دیده شوند، باید زمان بیشتری صرف نمود تا سیال شدن كامل شود.

2- در طی سیال شدن، مخلوط كردن یا چرخاندن نمونه بطور مستمر بر روی شیكر در حرارت اتاق یا 37 درجه می تواند به تشكیل یك نمونه همگن كمك كند.

3- اگر سیال شدن در 30 دقیقه رخ نداد، آنالیز اسپرم را شروع نكنید و30 دقیقه دیگر صبر كنید. در صورتی كه پس از 60 دقیقه باز هم نمونه سیال نشد، طبق دستورالعمل بخش زیر عمل كنید*.

* تاخیر در سیال شدن

گاهی ممكن است نمونه ها بطور طبیعی سیال نشوند و آنالیز اسپرم را با مشكل مواجه سازند. در این موارد می توان از یكی از روشهای زیراستفاده نمود.

1- اضافه كردن محلولA - سالین بافر فسفات دولبكو به نسبت 1/1 و پیپت كردن پی در پی  

2- روش مكانیكی كه در آن نمونه را چندین بار با سرنگی كه سرسوزن 18 یا 19 كندی دارد كشیده و به آرامی تخلیه می كنیم.

كه یك آنزیم پروتیولیتیك وسیع‌الطیف است و میتواند سیال شدن را تسریع نماید. bromelain3- هضم آنزیمی با بروملین

نكته: اینگونه روشها ممكن است بیوشیمی پلاسمای منی را تحت تاثیر قرار داده و بر حركت ومورفولوژی اسپرم اثر گذارد، لذا مصرف آنها باید در جواب بیمار گزارش شود. همچنین زمانی كه مایع منی را به نسبت 1/1 با بروملین مخلوط می كنیم، باید این رقت را در زمان شمارش اسپرم مد نظر داشت.

Viscosity ( ویسكوزیته منی )

پس ازسیال شدن، ویسکوزیته مایع منی رامی توان تعیین نمود. برای این کار نمونه را با یک پی پت یکبارمصرف که قطر نوک آن حدود 1.5 میلیمتر است به آرامی آسپیره نموده و سپس اجازه می دهیم تا قطره‌های مایع منی به کمک نیروی وزن خود از نوک پی‌پت چکیده و طول رشته حاصل را بررسی می کنیم. نمونه طبیعی بصورت قطرات مجزا از پیپت خارج می شود. اگر ویسکوزیته غیرطبیعی باشد، قطرات اسپرم ایجاد رشته‌های بیش از 2 سانتیمتر می‌کند.

ویسکوزیته را به روش دیگری نیز می توان تعیین نمود. برای این کار یک میله شیشه‌ای را داخل نمونه فرو برده و سپس خارج می کنیم و رشته‌های حاصل را بررسی می کنیم. در صورتی که رشته ایجاد شده بیش از 2 سانتیمتر باشد، ویسکوزیته غیرطبیعی گزارش می شود. برخلاف نمونه‌های غیر سیال، درنمونه‌هایی که ویسکوزیته بیش ازحد دارند، سفتی یکنواختی درمایع منی دیده می شود و با گذشت زمان قوام آن تغییر نمی‌کند. نمونه‌هایی که ویسکوزیته بالایی دارند، هنگام برداشتن با پی‌پت بدلیل چسبندگی زیادی که دارند مشخص می گردند. روشهایی که برای کاستن از ویسکوزیته وجود دارد مشابه همان‌هایی است که برای نمونه‌های غیرسیال بیان شد.

نکته: ویسکوزیته بالا در تعیین تحرک وغلظت اسپرم، تعیین اسپرمهای پوشیده از آنتی‌بادی و سنجش مارکرهای  بیوشیمیایی ایجاد تداخل می‌‌نماید.

 ظاهر مایع منی

نمونه منی که سیالیت طبیعی داشته باشد دارای ظاهری یکنواخت، خاکستری و نیمه کدر است. اگر تعداد اسپرم خیلی کم باشد، کدورت نمونه کمتر می شود. رنگ نمونه نیز می تواند متفاوت باشد، مثلا" درصورت وجود گلبولهای قرمز رنگ آن قرمز مایل به قهوه‌ای می شود (همواسپرمی) و در صورت بروز یرقان یا مصرف برخی ویتامینها و داروها رنگ نمونه زرد می شود.

حجم مایع منی

حجم انزال عمدتا" مربوط به وزیکولهای سمینال و پروستات است، ولی غدد پیازی- میزراهی و اپیدیدیم نیز بطور مختصر در مقدار آن تاثیر دارند. تعیین دقیق حجم مایع منی بسیار مهم است، زیرا محاسبه تعداد کل اسپرم‌ها و سلولهای دیگر در مایع منی وابسته به آن است. برای تعیین حجم می توان از روشهای زیر استفاده نمود:

الف - روش توزین

* ظرف نمونه گیری را ابتدا وزن نموده و سپس بیمار نمونه را در آن جمع آوری می‌کند.

* ظرف حاوی نمونه را مجددا" وزن نمایید.

* وزن مخصوص مایع منی را 1 فرض نموده و حجم آن را حساب کنید. ( وزن مخصوص واقعی مایع منی بین 1.043 و 1.102 متغیراست )

توجه: ظروف خالی ممکن است وزن‌های متفاوتی داشته باشند، لذا هر یک از آنها را قبل از استفاده باید توزین نمود. وزن ظرف را باید با استفاده از ماژیک روی ظرف یادداشت نمود. در صورتی که نام بیمار روی برچسب نوشته می شود، باید  ظرف را پس از چسباندن برچسب توزین نمود.

ب- روش مستقیم

نمونه را دریک استوانه مدرج دهانه گشاد بریزید و حجم را از روی درجات استوانه قرائت نمایید. (صحت اندازه گیری 0.1 میلی لیتر). کمترین مقدار مرجع برای مایع منی 1.5 میلی لیتر است.

نکته 1: حجم کم مایع منی، نشانه وجود انسداد در مجرای انزال و یا فقدان مادرزادی و دوطرفه وازدفران می باشد که در آن وزیکولهای سمینال نیز بطور کامل تکامل نیافته‌اند.

نکته 2: حجم کم مایع منی می تواند ناشی از اشکال در جمع آوری نمونه، انزال رتروگراد ویا کمبود آندروژن باشد.

نکته 3: افزایش حجم مایع منی ممکن است بدلیل افزایش ترشحات ناشی از التهاب غدد ضمیمه‌ای باشد.


PH مایع منی

مایع منی منعکس کننده تعادل بین ترشحات مختلف غدد ضمیمه‌ای بخصوص ترشحات قلیایی وزیکولهای سمینال و ترشحات اسیدی پروستات می باشد. اندازه گیری PH باید بعد ازسیال شدن نمونه، یعنی ترجیحا" 30 دقیقه پس از انزال انجام شود و در هر حال این زمان نباید پس از یکساعت باشد. برای نمونه های طبیعی از کاغذ PH سنج استفاده می کنیم که دامنه اندازه گیری PH آن 6 تا 10 است.

برای این کار :

*نمونه را به خوبی مخلوط نمایید

*یک قطره ازمایع منی را بطور یکنواخت روی کاغذ پخش نمایید

*صبر کنید تا رنگ حاصله یکنواخت گردد (کمتر از 30 ثانیه)

PH* را قرائت نمایید

*رنگ حاصله را با نوار کنترل مقایسه کنید.

توجه: صحت کاغذ PH بایستی با استانداردهای معین کنترل گردد. 


نکته 1: اگر PH مایع منی کمتر از 7 باشد و حجم و تعداد اسپرمها نیز پایین باشد، ممکن است نشانه انسداد در مجرای انزال و یا فقدان مادرزادی و دوطرفه وازدفران باشد .


نکته 2: با گذشت زمان خاصیت بافری مایع منی کاهش می یابد و درنتیجه PH افزایش می یابد، لذا بالا بودن آن ممکن است نتایج بالینی مفیدی بدست ندهد.