انجام تست (Sperm DNA Fragmentation (SDF

on . Posted in ناباروری

 

قطعه قطعه شدن DNA اسپرم یا  Sperm DNA Fragmentation (SDF) 

 

 

بخش مهمی از اطلاعات، مربوط به کیفیت مایع سمینال است و در موارد زیر کاربرد دارد:


1- تشخیص زوج مناسب برای درمان با IUI: در SDFهای بالاتر از 30% توصیه می شود که پزشکان از IUIهای غیر ضروری جلوگیری کرده و به طور مستقیم از IVF و یا ICSI استفاده کنند. 


2- ارزیابی نمونه منی: ممکن است نمونۀ منی از لحاظ تعداد، حرکت اسپرم و سایر خصوصیات مناسب باشد، ولی از جهت ساختار DNA دچار مشکل شده و قادر به باروری نباشد که این امر با تست Spermogram مشخص نمی شود و نیاز به تست SDF  می باشد.


3- برای ارزیابی اثر بخشی مداخلات پزشکی: در مردان نابارور با واریکوسل درصد بالایی از اسپرم ها دارای آسیب شدید DNA  می باشند که می توان قبل و بعد از انجام عمل اثر بخشی عمل را ردیابی نمود.


4- درمان بیماری عفونی: در عفونت های Chlamydia trachomatis و Mycoplasma همان طور که پارامترهای دیگر مایع منی از عفونت های دستگاه تناسلی تاثیر می پذیرد،

DNA  اسپرم نیز تحت تاثیر قرار گرفته و ممکن است دچار شکستگی شود. اندازه گیری SDF به پزشک کمک می کند که پاسخ درمانی را در بیمار بررسی نماید.


5- برای ارائه پاسخ به موارد ناباروری با علت ناشناخته در هنگام سقط جنین های مکرر: سطحSDF  بالا ممکن است بر کیفیت ماحصل لقاح اثر گذاشته و منجر به سقط های تکراری شود.


در مجموع پزشک در روبرو شدن با SDF های بالای 30% باید عواملی را که قطعه قطعه شدن DNA اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهد مورد بررسی قرار دهد که شامل موارد زیر است:
داروها، ترکیبات سمی، تب، سیگار کشیدن، مواد مخدر، بیماری های عفونی، واریکوسل، افزایش سن و پرهیز طولانی مدت آمیزش جنسی

SDF test

تصاویر CLSM و SEM از تست SDF : کنترل در روزهای 7 ، 14 و 21

ستاره ها اسپرم های فرگمنته هستند.


آزمایشگاه پاتولوژی و ژنتیک پارسه در ادامه راه اندازی تست ها و تکنیک های جدید آزمایشگاهی، با انجام تست SDF  فراگمانتاسیون   DNA  اسپرم را بررسی می کند.

 

زایش شکستگی DNA اسپرم انسان بعد از دو ساعت انکوباسیون

 در بسیاری از کلینیک‏ها، پارامترهای معمول نظیر تعداد، تحرک، مورفولوژی، برای بیان کیفیت اسپرم بررسی می‏ شود. تحقیقات نشان داده است که پارامترهای معمولی (تعداد، مورفولوژی، تحرک) در مردان نابارور نمی‏ تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد (1). به ‏تازگی لوئیس و سیمون  (2) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر‏های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد. اختلال در یکپارچگی DNA اسپرم می ‏تواند میزان لقاح را کاهش داده و میزان لانه گزینی جنین را تحت تاثیر قرار دهد. اگر چه احتمال اینکه اسپرم با DNA آسیب دیده بتواند با تخمک لقاح پیدا کرده و تشکیل جنین بدهد، وجود دارد (3) ولی احتمال از بین رفتن جنین و سقط افزایش پیدا می ‏کند (4).

یکی از عواملی که می ‏تواند بر میزان موفقیت درمان زوج‏های نابارور و همچنین کیفیت جنین‏ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش‏های کمک باروری (Assisted Reproductive Techniques) بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم، می‏ تواند به‏ خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند (5). پس از آماده سازی اسپرم، به‏ طور معمول اسپرم قبل از استفاده در (ART) در 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه می ‏شود (6)، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی‏گراد را دارند. نشان داده شده است که انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد بعد از گذشت 24 ساعت می‏ تواند بر روی تحرک اسپرم تاثیر گذار باشد، ولی بر روی قابلیت حیات تاثیری ندارد (7).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک‏های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد می‏ تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود، اما انکوباسیون طولانی مدت می ‏تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد (8). در آزمایشگاه‏های آندرولوژی، بعد از عمل شستشو و جداسازی، معمولا" به بررسی پارامترهای اسپرم شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می‏ پردازند، اما به بررسی پارامترهای درون سلولی (شامل شکستگی DNA اسپرم) پرداخته نمی‏ شود. همچنین در آزمایشگاه‏های ART معمولا" نمونه‏ های اسپرم از 0/5 تا حداکثر 3 ساعت و بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به‏ زمان بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم مورد استفاده قرار می‏ گیرد. با توجه به نقش اسپرم در فرایند لقاح در روش‏های ART، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به‏ داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می ‏توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد. هدف از این مطالعه به‏ دست آوردن بهترین زمان برای انکوباسیون اسپرم‏های نرمال شسته شده به ‏روش Direct swim-up برای استفاده در تکنیک‏های کمک باروری می‏ باشد.

مواد و روشها

جمع آوری و آنالیز Semen: در این مطالعه آینده نگر، 21 نمونه نرمال از مردهای نابارور مراجعه کننده به پژوهشکده علوم تولید مثل یزد با رعایت اصول اخلاقی جمع آوری شد. نمونه مایع منی افراد پس از 2 تا 7 روز خودداری از مقاربت به ‏وسیله‏ ی خود انزالی در ظروف دهان گشاد جمع آوری شد. سپس برای مایع شدن، نمونه Semen به ‏مدت 20 تا 30 دقیقه درون انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. آنالیز مایع منی طبق دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی(WHO2010) انجام شد (9).

آماده سازی اسپرم: پس از آنالیز، نمونه ‏ها به ‏وسیله‏ ی روش Direct swim-up آماده شدند. به این صورت که میزان 1/5 میلی ‏لیتر محیط کشت 10+Ham’s F 5 میلی ‏گرم بر میلی‏ لیتر آلبومین سرم انسانی(HSA) درون لوله فالکون 15 میلی‏ لیتری ریخته شد و سپس 1 میلی‏ لیتر از نمونه به ‏وسیله پیپت پاستور به ته لوله اضافه شد. لوله فالکون با زاویه 45 درجه به ‏مدت یک ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. سپس 2/3 مایع رویی جدا شده و داخل یک لوله ریخته شد. 1/5 تا 2 میلی‏ لیتر محیط کشت اسپرم به تست تیوپ اضافه شد و به ‏مدت 5 دقیقه با دور g500-300 سانتریفوژ شد. بعد از سانتیریفیوژ، 0/5 میلی ‏لیتر محیط کشت اسپرم ته لوله روی رسوب تشکیل شده باقی گذاشته و سپس رسوب درون محیط کشت اسپرم باقی مانده حل شد (9).

شمارش و ارزیابی تحرک: برای شمارش تعداد و ارزیابی تحرک اسپرم از لام Makler chamber استفاده شد. برای شمارش، 10 میکرولیتر از نمونه، توسط سمپلر روی قسمت وسط لام MAKLER CHAMBER قرار داده شد و سپس لامل روی نمونه قرار گرفت. این لامل از 100 خانه 10×10 تشکیل شده  و با بزرگنمایی X20، تعداد اسپرم‏های موجود در 10 مربع عمودی و 10 مربع افقی پشت سر هم شمارش شد و میانگین این دو گرفته شد. سپس عدد به دست آمده در 106 ضرب شد تا تعداد اسپرم در یک میلی‏ لیتر برحسب میلیون به ‏دست آید. برای ارزیابی تحرک اسپرم، 10 میکرولیتر از نمونه بر روی لام MAKLER CHAMBER قرار گرفت، با لامل پوشانده شد و با بزرگنماییX20 ، انواع حرکت اسپرم‏ها بررسی شد. تعداد اسپرم‏های دارای حرکت سریع پیشرونده (a)، آهسته پیشرونده (b)، حرکت درجا (c)، واسپرم‏های بی‏حرکت (d) را در مربع‏های مختلف مشاهده و با کانتر شمارش شد تا به صورت درصد بیان شود (9). نتایج برای هر نمونه قبل و بعد از شستشو به ‏روش Swin-up Direct ثبت شد.

ارزیابی قابلیت حیات: برای ارزیابی قابلیت حیات از رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین استفاده شد. برای ساخت رنگ ابتدا 0/67 گرم پودر ائوزینY با 0/9 گرم سدیم کلرید در 100 میلی ‏لیتر آب مقطر حل و سپس به آن 10 گرم پودر ائوزین- نیگروزین (MERCK, Germany) اضافه کردیم (9). 10 میکرولیتر از رنگ ائوزین- نیگروزین به‏ درون یک میکروتیوپ ریخته شد و سپس 10 میکرولیتر نمونه درون میکروتیوپ حاوی رنگ اضافه شد و با عمل پیپتینگ با ائوزین- نیگروزین مخلوط شد. پس از 30 ثانیه 10 میکرولیتر از آن برداشته و از آن گسترش تهیه شد. گسترش‏ها توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X 1000 بررسی شد (شکل 1). اسپرم‏هایی که رنگ را به خود گرفته و قرمز یا صورتی شده اند مرده و آنهایی که رنگ را به خود نگرفته اند زنده در نظر گرفته شد(9). تعداد 200 اسپرم شمرده شد و نتایج قبل و بعد از شستشو به ‏روش Direct swim up ثبت گردید.

ارزیابی مورفولوژی: برای بررسی مورفولوژی از رنگ آمیزی پاپانیکولا  طبق دستورالعمل WHO 2010 (9) که سر به رنگ آبی و قطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می‏ آید، استفاده شد. جهت بررسی مورفولوژی اسپرم، ابتدا از هر نمونه گسترش تهیه شد تا بعدا" به‏ طور یک‏جا رنگ آمیزی پاپانیکولا (MERCK, Germany)  روی آن‏ها انجام شود (9). برای هر نمونه یک لام قبل از عمل Direct Swim-up  و یک لام بلافاصله بعد از عمل Direct Swim- up به ‏صورت فیکس شده از اسپرم تهیه شد. پس از رنگ آمیزی، تعداد 200 اسپرم با بزرگنمایی X1000 بررسی شد.

تست TUNEL: بعد از آماده سازی و آنالیز اسپرم در لوله حاوی اسپرم آماده شده به روش   Direct Swim-up محکم بسته شد و درون انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت تا میزان شکستگی DNA  اسپرم‏ها در زمان‏های مختلف (3،2،1،0 ساعت) انکوباسیون توسط تست TUNEL بررسی شود. برای انجام تکنیک TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)  از کیت سنجشی تانل (Roche, Germany) استفاده شد. ابتدا غلظت نمونه شسته شده به 20 میلیون رسانده و گسترش تهیه شد. پس از خشک شدن گسترش‏ها در دمای اتاق، گسترش‏ها در متانول 100 درصد به‏ مدت 4 دقیقه فیکس و سپس به ‏منظور شستشو شده به ‏مدت 30 دقیقه در محلول (×1) PBS قرار گرفت. سپس گسترش‏ها در محلول blocking  ( H2O2 3 درصد در متانول) به‏ مدت 10 دقیقه در دمای 15 تا 25 سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS به مدت 5 دقیقه گسترش‏ها با محلول تریتون 0/1 درصد در سدیم سیترات 0/1 درصد به مدت 2 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. سپس گسترش‏ها با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو شد. برای هر لام، 5 میکرو‏لیتر محلول آنزیم و 45 میکرو‏لیتر محلول لیبل درون یک میکروتیوپ با هم مخلوط شد و به تمام قسمت‏های لام اضافه شد و به‏ مدت 1 ساعت در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. پس از شستشو با PBS، (سه بار و هر بار 5 دقیقه) گسترش‏ها باconverter – probe  به مدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفتند. سپس گسترش‏ها با محلول DAB)  DAB  ، 500 میکرولیتر(substrate(H2O2) + ، 5/4 میکرولیتر) به ‏مدت 20 دقیقه  در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. دوباره عمل شستشو با PBS انجام شد. آبگیری از نمونه‏ ها توسط الکل های 25، 50، 75 و 100 درصد (هر کدام 5 دقیقه) صورت گرفت. شفاف سازی نمونه‏ ها به وسیله ‏ی زایلن و چسباندن توسط چسب انتلان انجام شد (10). سپس، با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×1000 مشاهده و تعداد 200 اسپرم شمارش شد. سلول‏های با رنگ قهوه‏ ای تیره دارای شکستگی DNA و TUNEL مثبت در نظر گرفته شد و سلول‏های بدون رنگ و قهوه ‏ای کم رنگ بدون شکستگی DNA و  TUNEL منفی در نظر گرفته شد (شکل 2).

آنالیز آماری: برای آنالیز داده‏ ها، از نرم افراز SPSS 15 استفاده شد. از  test - pair، برای مقایسه پارامترهای اسپرم قبل و بعد از شستشو و از تست ANOVA یک طرفه با تست تکمیلی Tukey برای مقایسه شکستگی  DNA اسپرم در زمان‏های مختلف استفاده شد. همچنین جهت بررسی بین زمان انکوباسیون و شکست DNA اسپرم، آزمونPearson  خطی مورد استفاده قرارگرفت. 0/05 P< به ‏عنوان مرز معنی‏ داری داده ‏ها در نظر گرفته شد.

نتایج

جدول 1 مقایسه‏ ای بین طرح‏های مختلف حرکتی، مورفولوژی طبیعی و قابلیت حیات  اسپرم انسان قبل و بعد از و آماده سازی به روش Direct swim-up را نشان می‏ دهد. نتایج بیانگر آن است که درصد حرکت پیشرونده و حرکت سریع پیشرونده بعد از آماده سازی در مقایسه با قبل از آماده سازی به‏ طور معنی‏  داری (0/001P<) افزایش، در حالی‏که حرکات آهسته و درجا بعد از آماده سازی نسبت به قبل از آماده سازی به طور معنی ‏داری (0/001P<) کاهش یافت. با این وجود تغییر قابل ملاحظه ‏ای در حرکات آهسته اسپرم بین این دو گروه مشاهده نشد. علاوه بر این، مورفولوژی طبیعی اسپرم و همچنین قابلیت حیات اسپرم‏ها افزایش معنی ‏داری (0/001P<) را بعد از آماده سازی در مقایسه با قبل از آماده سازی نشان داد.

افزایش معنی داری در درصد شکستگی DNA اسپرم بعد از انکوباسیون مشاهده شد. درصد شکستگی DNA اسپرم بعد از یک ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر، همچنین دو ساعت نسبت به یک ساعت و سه ساعت نسبت به دو ساعت معنی ‏دار نبود. با این ‏حال، افزایش معنی‏ داری در درصد شکستگی DNA اسپرم پس از دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر (0/01P<) و همچنین سه ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر و یک ساعت (0/001P<)  مشاهده شد (نمودار 1).

همچنین، یک رابطه معکوس بین میزان شکستگی DNA نمونه ها، با حرکت سریع، حرکت کند، مورفولوژی و یک رابطه مستقیم بین درصد شکستگی DNA نمونه‏ ها، با حرکت درجا و بی حرکت دیده شد (جدول 2).

جدول 1: مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up

 پارامترهای اسپرم  قبل از آماده سازی اسپرم  بعد از آماده سازی اسپرم
 حرکت سریع پیشرونده (%)  2/57±48/20 27/3±52/ 42* 
 حرکت آهسته پیشرونده (%)  2/30±24/43  80/3±71/ 47* 
 حرکت درجا (%)   0/07±36/5 0/75±24/4 * 
 بی حرکت (%)  1/63±81/29  0/57±52/5 * 
 حرکت پیشرونده (%)  1/83±71/63  1/02±10/90 * 
 مورفولوژی طبیعی (%)  3/10±00/49  2/53±33/72 * 
 قابلیت حیات (%)  1/65±29/82   0/000±100 *

داده ‏ها به‏ صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده. 0/0001>p*، حرکت پیشرونده شامل حرکت سریع پیشرونده + حرکت آهسته می‏ باشد.

نمودار: مقایسه میانگین شکستگی DNA  اسپرم انسان در زمان‏های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به‏ روش Direct Swim-up با استفاده از تکنیک .TUNEL *میزان شکستگی DNA بعد از دو ساعت نسبت به زمان صفر با در نظر گرفتن سطح معنی داری 0/05 به‏ طور معنی‏ داری افزایش یافت. ** شکستگی DNA بعد از سه ساعت نسبت به ‏زمان صفر و یک ساعت با در نظر گرفتن سطح معنی داری 0/05 به ‏طور معنی‏ داری افزایش یافت. داده‏ ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است.

جدول 2 : رابطه میزان شکستگی DNA اسپرم انسان با سایر پارامترهای اسپرم

حرکت سریع

حرکت آهسته

متغیر ها

حرکت پیشرونده

مورفولوژی طبیعی

حرکت درجا بی حرکت

0/006-r=

0/0001> *

0/090-r=

0/330

0/178r=

0/222

0/402r=

0/0001> *

0/334-r=

0/001*

0/106-r=

0/0001> *

 P –value، r: ضریب همبستگی

بحث

در این تحقیق همانطور که انتظار می ‏رفت، میزان تحرک اسپرم و اسپرم‏های با مورفولوژی سالم و همچنین اسپرم‏های زنده نسبت به قبل از شستشوی اسپرم به روش Direct swim up افزایش چشمگیری داشتند و نیز میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوزیس به‏ طور معنی‏ داری نسبت به قبل از آماده سازی اسپرم به روش  Direct swim up افزایش نشان داد.

محققین دیگری نیز به نتایج مشابهی در مورد بهبود پارامترهای اسپرم در روش Swim up دست یافتند،  به‏ طوری‏که اسپرم‏های جمع آوری شده، هم از نظر تعداد و هم از نظر مورفولوژ‏ی طبیعی از میزان بیشتری نسبت به روش‏های د‏یگر برخوردار بودند (11). بعضی از محققین با مقایسه دو روش Swim up و Percoll Gradient به این نتیجه رسیدند که اگرچه تعداد اسپرم در روش Percoll به‏ صورت معنی ‏داری بیشتر از روش Swim up است، ولی درصد حرکت پیشرونده در روش Swim up بیشتر است. همچنین این روش برای افزایش قابلیت باروری در سیکل‏های درمانی و حذف اسپرم‏هایی که از بلوغ کمتری برخوردار بوده و یا در مرحله آناپلوئیدی به سر می‏ برند، مناسب می ‏باشد (12). علی‏رغم این که روش‏های مختلفی برای جداسازی اسپرم وجود دارد، اما بسیاری همچنان بر روش شستشو و Swim up مایع Semen تاکید داشته و آن را برای دستیابی به اسپرم‏های با حرکت بیشتر و پیشرونده، مناسب می‏ دانند (13).

یکی دیگر از پارامترها‏ی اصلی اسپرم، میزان مورفولوژی طبیعی آن است که نقش تعیین کننده‏ای در باروری افراد دارد. لذا اگر طی انجام روشی بتوان میزان بیشتری از اسپرم‏های طبیعی را جمع آوری نمود، مسلما میزان باروری نیز افزایش خواهد یافت. Younglai به مقایسه تاثیر یک بار و دوبار شستشو در روش Swim up بر مورفولوژی سر اسپرم پرداخت و به این نتیجه دست یافت که دو بار شستشو در روش Swim up باعث می ‏شود تا اسپرم‏هایی که دارای شکل طبیعی و داری واکنش آکروزومی بهتری هستند جدا شوند و یا اسپرم‏هایی جدا شوند که از توانایی بیشتری در مقابل محیط هیپواسماتیک برخوردارند. عده‏ ای نیز بر این باورند که در روش Swim up میزان  قطعه قطعه شدن DNA نیز به صورت معنی‏ داری کاهش می‏ یابد (14). نتیجه این تحقیق مؤید آن است که کاهش میزان میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم می‏ تواند باعث افزایش لقاح و تشکیل جنین در روش‏های کمک باروری (ART) و همچنین افزایش میزان حاملگی و تولد نوزاد زنده شود. بعضی از مطالعات نشان می ‏دهد که اگر چه روش Swim up شاید کمک چندانی به نمونه‏ های طبیعی ننماید و حتی ممکن است در این خصوص روش‏هایی مثل Percoll Gradient بهتر از آن عمل نماید، ولی این روش در نمونه‏ های اولیگواسپرمی،  آستنواسپرمی و تراتواسپرمی کاملا" تاثیر خود را نشان داده و باعث می گردد تا اسپرم‏های طبیعی بیشتری جدا شوند و درمان ناباروری از نتایج بهتری برخوردار باشد (15). به همین دلیل، بعضی از محققین انجام Swim up double washing را پیشنهاد داده و معتقدند که این روش مخصوصا" برای انجام  IVF که اسپرم ها باید در اطراف اووسیت قرار گرفته و در محیط انکوباتور لقاح انجام پذیرد ؛ بسیار مناسب بوده و نتایج بهتری را به ‏دنبال خواهد داشت (16). همین ایده در روش آماده سازی اسپرم برای انجام IUI نیز وجود داشته و بسیار موثر بوده، منتها روش Swim up تک مرحله ‏ای آسان‏تر و کم هزینه ‏تر بوده است (17).

انکوباسیون اسپرم آماده شده و شسته شده در دمای 37 درجه سانتی‏گراد برای استفاده در تکنیک‏های کمک باروری (ART) امری معمول است که در مراکز ناباروری صورت می گیرد. بررسی تأثیر انکوباسیون آزمایشگاهی اسپرم از پژوهش‏هایی است که مورد توجه محققین در دهه‏ ی اخیر قرار گرفته است. تحقیقات اولیه در مورد اثر انکوباسیون اسپرم بر روی پارامترهای اسپرم نظیر تحرک، قابلیت حیات و مورفولوژی بوده است. با مشخص شدن نقش مهم سلامت و کیفیت DNA اسپرم در باروری و موفقیت تکنیک‏های کمک باروری، بسیاری از گروه‏های تحقیقاتی تلاش های زیادی برای پیدا کردن ارتباط بین انکوباسیون کوتاه مدت و طولانی مدت سلول‏های اسپرم با یکپارچگی DNA اسپرم انجام داده اند (7, 18-20). در این مطالعه آینده نگر سعی بر پیدا کردن اثر زمان‏های مختلف بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA و شکستگی DNA سلول های اسپرم نرمال آماده شده به روش Direct swim-up در اثر انکوباسیون در  دمای 37 درجه سانتی‏گراد داشتیم، که بررسی میزان شکستگی DNA اسپرم به ‏وسیله تکنیک TUNEL صورت گرفت. نتیجه این مطالعه نشان داد که بعد از گذشت دو ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد میزان شکستگی DNA اسپرم به‏ میزان قابل توجهی افزایش پیدا می‏ کند. به‏ تازگی Matsuura و همکاران (18) اثر انکوباسیون اسپرم در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد بدون CO2 و با CO2 را بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم بررسی کردند. آن‏ها دریافتند که پس از گذشت 3 ساعت و 24 ساعت میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در انکوباتور CO2 دار نسبت به بدون CO2 به‏ صورت معنی ‏داری بالا بود. همچنین میزان شکستگی DNA اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نسبت به دمای اتاق به‏ صورت معنی‏ داری افزایش یافت. آن‏ها از روش Sperm chromatin structure assay برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA استفاده کردند. Dalzell و همکاران (21) نشان دادند که DNA اسپرم حاصل از عمل TESE بعد از گذشت 4 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‏گراد دچار آسیب می شود.

Hammadeh و همکاران (22) نشان دادند که انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد بازشدگی و خارج شدن از حالت فشرده هسته اسپرم هنگام لقاح با تخمک را کاهش می‏ دهد. آن‏ها مشاهده کردند که بعد از دو ساعت انکوباسیون، میزان عدم خروج هسته ‏ی اسپرم از حالت فشرده از 25 درصد به 88 درصد افزایش پیدا می ‏کند. در یک مطالعه که توسط Fernandez و همکاران (23) در مورد پویایی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم اسب نر انجام شده نشان دادند که بیشترین میزان آسیب که به DNA اسپرم وارد شده زمان های بیش از 6 ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد می‏ باشد. در این تحقیق از تست Sperm Chromatin Dispersion برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم استفاده شده بود. همچنین اثر مضر دیگری که انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد روی اسپرم می‏ گذارد، تغییرات مورفولوژیکی سر اسپرم است که میزان باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار می‏ دهد و باعث کاهش میزان باروری اسپرم می‏ شود. Peer و همکاران (24) نشان دادند که میزان DNA اسپرم‏های دارای واکوئل بعد از دو ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نسبت به دمای 21 درجه سانتی‏گراد به ‏میزان معنی ‏داری افزایش پیدا می‏ کند.

یافته‏ هایی که ما در این مطالعه به ‏دست آوردیم با یافته ‏های دیگر محققان در مورد قطعه قطعه شدن DNA اسپرم پس از آماده شدن به روش Direct swim-up مشابه است (18-19). Zhang و همکاران (20) نشان دادند که قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از 4 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد افزایش می‏ یابد، در حالی‏که آن‏ها هیچ تفاوت معنی‏داری را پس از دو ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد مشاهده نکردند. ممکن است علل احتمالی این نتایج به‏ خاطر روش آماده سازی اسپرم باشد. Zhang و همکاران اسپرم را به‏ روش Indirect swim-up آماده کردند در حالی‏که ما به ‏روش Direct swim-up آماده سازی و شستشوی اسپرم را انجام دادیم و همچنین محیط کشتی که برای آماده سازی و نگهداری اسپرم که Zhang و همکاران استفاده کردند با مطالعه‏ ی ما متفاوت است، به ‏طوری که آن‏ها از محیط Ham's F10 همراه با G-IVF استفاده کردند، در حالی‏که ما از Ham's F10 به همراه آلبومن 5 درصد استفاده کردیم. یکی دیگر از تفاوت‏هایی که وجود داشته نحوه ‏ی انکوباسیون اسپرم بوده است که Zhang و همکاران، اسپرم را در انکوباسیون CO2 دار 5 درصد در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه کردند، در حالی‏که ما اسپرم را در انکوباسیون بدون CO2 در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه کردیم.

نتایج ما بر خلاف نتایج Calamera و همکاران (7) است. آن‏ها ارزیابی اثر گذشت زمان (بلافاصله پس از شستشوی اسپرم به روش Swim-up تا 47 ساعت) بر روی پارامترهای اسپرم و یکپارچگی DNA انجام دادند و دریافتند که تفاوت معنی‏ داری بین زمان‏های مختلف انکوباسیون بر روی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم وجود ندارد. یکی از علت‏های احتمالی مربوط به ‏روش مورد استفاده برای ارزیابی قطعه قطعه شدن DNA است که مورد استفاده قرار گرفته است. آن‏ها از روش آکریدین اورنژ (AO) برای بررسی یکپارچگی DNA اسپرم مورد استفاده قرار دادند، در حالی‏که ما در این تحقیق از روش TUNEL برای بررسی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم استفاده کردیم. روش‏های آکریدین اورنژ و TUNEL و دیگر روش‏های بررسی آسیب DNA روش‏های متغیر وابسته به فرد هستنند یعنی ممکن است نتایج از فردی به فرد دیگر تا حدودی متغیر باشد.

Yavas  و همکاران (25) اثر زمان انکوباسیون اسپرم را در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در تلقیح خارج رحمی اسپرم (IUI) و نتایج حاملگی بررسی کردند. آن‏ها نشان دادند که اگر اسپرم آماده شده برای IUI بیش از 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شود، باعث کاهش میزان حاملگی به روش IUI می شود. نتایج ما هم نشان می‏ دهد که یکی از علل کاهش میزان حاملگی و تولد فرزند زنده می ‏تواند در اثر زمان طولانی انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد باشد که بر روی DNA اسپرم اثر می‏ گذارد.

Lachaud و همکاران (26) به این نتیجه رسیدند که انکوباسیون اسپرم پس از چهار ساعت هیچ تاثیری برروی پارامترهای اسپرم و شکستگی DNA ندارد. آنها بیان کردند انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد باعث نکروز سلول‏های اسپرم می ‏شود و باعث شکستگی DNA نمی شود. آن‏ها معتقدند که اسپرم نرمالی که به صورت طبیعی از فرد گرفته شده باشد، مسیر شکستگی DNA را طی نمی‏ کند. یکی از علل آسیب DNA اسپرم ممکن است به خاطر استرس اکسیداتیو باشد. نشان داده شده است که استرس اکسیداتیو، رادیکال‏های فعال اکسیژن  را طی انکوباسیون آزمایشگاهی اسپرم افزایش می ‏دهد (7). سلول‏های اسپرم نسبت به رادیکال‏های فعال اکسیژن حساس و آسیب پذیر هستند که این حساسیت و آسیب پذیری به دلایل مختلفی از قبیل حضور اسید چرب غیر اشباع بالا در غشای اسپرم و عدم وجود آنتی اکسیدانت کافی در سیتوپلاسم اسپرم است. همچنین سلول‏های اسپرم خود تولید رادیکال‏های فعال اکسیژن می کنند. بیشترین میزان رادیکال‏های فعال اکسیژن پس از 24 ساعت انکوباسیون اسپرم تولید می‏ شود (7). پس در انکوباسیون‏های طولانی مدت نقش رادیکال‏های فعال اکسیژن در آسیب DNA یک علت غیر قابل انکار به ‏نظر می‏رسد. محققین دیگر قطعه قطعه شدن DNA اسپرم را پس از انکوباسیون آزمایشگاهی اسپرم بعد از 4 ساعت مورد بررسی قرار دادند (5). آن‏ها برای مهار کردن فعالیت اندونوکلئاز از مهارکننده‏ای اندونوکلئاز (ATA) استفاده کردند و اسپرم را برای مدت 4 و 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه کردند. آن‏ها نشان دادند که مهار کننده اندونوکلئاز (ATA) هیچ تأثیری بر روی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در زمان‏های مختلف انکوباسیون نداشت. می‏ توان گفت که استرس اکسداتیو و تولید رادیکال فعال اکسیژن توسط اسپرم به ‏عنوان یک علت احتمالی برای آسیب به DNA مطرح است.

نگهداری طولانی مدت اسپرم در محیط کشت نیز یکی از علت های محتمل آسیب به DNA می ‏باشد. انکوباسیون طولانی مدت اسپرمی که در محیط کشت ساده که فاقد مواد مغذی است نیز باعث آسیب به DNA اسپرم می شود. از سوی دیگر نتایج به‏ دست آمده مشابه با کاری است که Bungum و همکاران (27) انجام دادند. آن‏ها گزارش دادند که پس از گذشت دو ساعت انکوباسیون اسپرم آماده شده به ‏روش شیب غلظت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به ‏میزان معنی‏ داری نسبت به انکوبه کردن اسپرم در دمای اتاق (24-23 درجه سانتی‏گراد) افزایش می ‏یابد.

نتیجه گیری

بهترین زمان برای انکوباسیون اسپرم طبیعی انسان در دمای 37 درجه سانتی‏گراد که به‏ روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک‏های کمک باروری در محدوده زمانی دو ساعت می‏ باشد.

تشکر و قدردانی

از مدیریت پژوهشکده علوم تولید مثل یزد به‏ خاطر حمایتشان و راهنمایی‏های سرکار خانم ساره عاشورزاده در انجام این پژوهش تشکر و قدرانی می‏ شود.